个人关于NK细胞培养的经验分享及见解

chenlin080102

首先介绍一下本人自己的研究成果吧，目前能利用外周血来源PBMCs培养17天，扩增120倍，纯度（CD3-CD56+)达到70%左右。
. D7 A$ A  o; N& }1 C$ M/ C# i3 i大致培养过程：6 A% m5 a2 N" a6 Y% P
D0+ g5 ~1 _  ]# D% Y' t
用肝素钠抗凝的采血管采集外周血，按照常规方法分离及获取自体血清灭火冷冻备用；将细胞密度调整未200万/ml。$ J, Z; L; Z+ c
培养瓶可以选择用单抗提前包被过夜，也可以用溶解性单抗，再加入相应的刺激因子（包括激活剂）培养。
1 |! O( c, H0 M6 b9 [1 r" LD3
* M! \- K/ h+ B' ^对细胞进行离心换液，并将细胞转移至新的培养瓶中，此时培养液中不许添加激活剂，只需要扩增因子，将密度重新调整为200万/ml
) u/ Z' c( B/ m9 i) Q: z" {  f4 b- fD6-D17  O  {$ r* L4 a. Z4 d% g
每隔两天计数并调整密度为200万/ml; A3 B, @1 m& a$ t- G/ T
D172 p/ Y! ]/ J" D: x( _: B1 _6 V/ R3 [
收集细胞并表型检测。
( b8 M& W  ~& p2 A* t) J此技术取50毫升外周血培养17天能达到60亿细胞，纯度达70%左右。4 I- {' V% Q; `" k+ ?$ g" M

; Q7 l) k* b! U( X2 T$ ^另外再分享一下开发NK工艺的经验
5 {2 D, Z  C/ O0 t6 T2 \) W2 J3 X1、查看很多文献里面都是利用IL-2和IL-15或者再添加另外的白介素类因子去培养，本人验证了非常多次都无法实现，要么数量上不去，要么纯度上不去。( U4 w6 }  U9 H5 j  j( ~
2、另外很多文献选择利用磁珠分选的方法培养，这个方法的缺陷在于分选成本高，而且纯NK扩增慢，而且分选后所得起始细胞数太少，所以最后虽然纯度达到了，但是数量还是很难满足临床需求，要是用于科研的话另当别论了。
  c" J+ t* T0 r4 {8 O, y6 k3、还有一个能在纯度和数量上都满足的培养工艺就是利用基因改造的K562细胞（在K562表面加入两个跨膜蛋白）做滋养细胞，培养半个月能扩增200倍的样子，但是好像这个工艺在临床上存在一定的伦理问题，毕竟滋养细胞本身就是癌变细胞，虽然在理论上是能用射线完全灭活K562，但是实际情况就不得而知了（此工艺我也做过）。' u* ^: J( F- E3 ~: A

% c1 a: n1 R* W2 j4 z* [+ w  M以上纯属个人在做NK培养工艺过程的一些想法。" x4 `' y' W+ ]# X- N/ I
另外对NK培养提几点经验：" L5 F1 w# e5 Z/ H9 m9 ^$ t, O
1、个人觉得临床上还是用纯因子刺激的方法比较好，另外为什么只用纯粹的白介素类因子不能大量扩增，因为这些都不是很强烈的激活刺激剂，缺乏强有力的激活调动剂。这些白介素类因子在细胞活化后维持活性及扩增是没问题的，所以建议还在做优化的朋友可以考虑添加合适的刺激佐剂，具体的就不便透露了。
/ {) P! H' q$ c2、培养基的选择也比较重要，同时也不是越贵越好0 N1 |5 b1 h0 `. A8 d) w6 q
3、个人的经验来看NK的培养密度还是挺重要的，特别是接种密度，当接种密度低于200万/ml时扩增时间明显滞后，可能与个人工艺相关吧。
5 v# A' `% y$ w- j4、不同品牌的因子也比较重要，因为不同品牌的效价是不一样的，建议多尝试。

cg001

不错，这个对于NK细胞的培养是有指导意义

暖羊羊

回复 chenlin080102 的帖子4 t& R2 {4 T7 L* C3 l7 }# j0 V
/ N  B, J; }6 W+ A: u
楼主的意思是  不加扩增剂（基因改造的K562），只加刺激、扩增因子即可在17d达到扩增120倍的结果？这很好呀，可以弱弱的问扩增因子除了白介素类得还有什么吗？如果不方便说具体的，可以说功能，我们自己摸索，最近实验室也想尝试不用滋养细胞培养的方法。

chenlin080102

回复 暖羊羊 的帖子, W* W* Y/ g/ U8 Z( H; ^

. T7 @3 }5 P( x9 ~可以选择添加一些临床用药作为刺激佐剂，跟免疫功能相关的药物

syj7888

NK细胞用白介素21刺激不是更好吗？不过需要太多，所以成本增加很多，太贵，所以才会用K562方法

lunyuyuanxj

曾经做过一组实验，纯度能达到50%以上，数量也不少，具体记不清了，但重复试验时效果不理想

yanglixia1984

什么是激活剂 什么是扩增剂？D3天只加了扩增剂，什么时候添加激活剂呢

chenlin080102

回复 syj7888 的帖子
  \: @& ~  T  N4 u* K6 Z
3 Z, V( |( r$ r8 L: z, F尝试过IL21对NK培养的效果并不是很理想，单纯依靠这些白介素是很难在数量和纯度上都达到理想效果的，如果使用IL21的话生产成本就会很高。

chenlin080102

回复 lunyuyuanxj 的帖子
: X8 J9 |* `, x, o  ]& H4 F6 [) n/ C- _. A! U/ y
这应该是个体差异的个例吧

shellyanlanlan

学习了