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首先介绍一下本人自己的研究成果吧，目前能利用外周血来源PBMCs培养17天，扩增120倍，纯度（CD3-CD56+)达到70%左右。2 ]# A9 l2 j H
大致培养过程：
4 a. a% h# @+ X* d9 OD0- [1 u& l" ?7 g0 N# w8 ]5 R; y6 i
用肝素钠抗凝的采血管采集外周血，按照常规方法分离及获取自体血清灭火冷冻备用；将细胞密度调整未200万/ml。
p+ n0 @9 E6 f1 Q培养瓶可以选择用单抗提前包被过夜，也可以用溶解性单抗，再加入相应的刺激因子（包括激活剂）培养。
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1 X) ]/ h$ K4 R对细胞进行离心换液，并将细胞转移至新的培养瓶中，此时培养液中不许添加激活剂，只需要扩增因子，将密度重新调整为200万/ml4 P3 G+ \6 R9 G9 \# H3 y3 v* ^
D6-D17% a$ c0 f0 ?- o1 I% i8 y7 }
每隔两天计数并调整密度为200万/ml
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- O! W h4 C, o, B- A3 O9 j X, d1 r# _收集细胞并表型检测。
* h0 l- W: z& F9 b此技术取50毫升外周血培养17天能达到60亿细胞，纯度达70%左右。( U5 f* u$ w4 j
8 ~& E/ K4 _# \9 q另外再分享一下开发NK工艺的经验
" J# J1 H% F* Z8 F. ]+ c1、查看很多文献里面都是利用IL-2和IL-15或者再添加另外的白介素类因子去培养，本人验证了非常多次都无法实现，要么数量上不去，要么纯度上不去。
. r% t: w3 P2 U5 G3 |# Q# M* @0 g2、另外很多文献选择利用磁珠分选的方法培养，这个方法的缺陷在于分选成本高，而且纯NK扩增慢，而且分选后所得起始细胞数太少，所以最后虽然纯度达到了，但是数量还是很难满足临床需求，要是用于科研的话另当别论了。5 j- G2 I5 J' X: M! m
3、还有一个能在纯度和数量上都满足的培养工艺就是利用基因改造的K562细胞（在K562表面加入两个跨膜蛋白）做滋养细胞，培养半个月能扩增200倍的样子，但是好像这个工艺在临床上存在一定的伦理问题，毕竟滋养细胞本身就是癌变细胞，虽然在理论上是能用射线完全灭活K562，但是实际情况就不得而知了（此工艺我也做过）。2 V* }8 Q, R0 `
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以上纯属个人在做NK培养工艺过程的一些想法。
. M+ t1 h# u S0 Q# Q* S$ }另外对NK培养提几点经验：
% ?+ F8 I: \, B1、个人觉得临床上还是用纯因子刺激的方法比较好，另外为什么只用纯粹的白介素类因子不能大量扩增，因为这些都不是很强烈的激活刺激剂，缺乏强有力的激活调动剂。这些白介素类因子在细胞活化后维持活性及扩增是没问题的，所以建议还在做优化的朋友可以考虑添加合适的刺激佐剂，具体的就不便透露了。
: _0 P7 ?3 T3 \, i" g$ X8 v5 C" p2、培养基的选择也比较重要，同时也不是越贵越好- @4 U+ ]+ u" n' Q2 e
3、个人的经验来看NK的培养密度还是挺重要的，特别是接种密度，当接种密度低于200万/ml时扩增时间明显滞后，可能与个人工艺相关吧。
* r. }, h* ~* Z! s E( [$ S4、不同品牌的因子也比较重要，因为不同品牌的效价是不一样的，建议多尝试。 |
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发表于 2015-4-29 22:16
