个人关于NK细胞培养的经验分享及见解

chenlin080102

首先介绍一下本人自己的研究成果吧，目前能利用外周血来源PBMCs培养17天，扩增120倍，纯度（CD3-CD56+)达到70%左右。2 X% y  g- S* j  i% K7 w
大致培养过程：2 B5 T  w6 D1 E5 }) h
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7 U# p9 L" T- B3 K) Q用肝素钠抗凝的采血管采集外周血，按照常规方法分离及获取自体血清灭火冷冻备用；将细胞密度调整未200万/ml。) Q' |9 \5 ?% K% x: B9 z% v
培养瓶可以选择用单抗提前包被过夜，也可以用溶解性单抗，再加入相应的刺激因子（包括激活剂）培养。
' b7 a/ x: }- E0 \+ u! y7 p$ @# nD3( G6 Y2 X8 {! E" g. F/ r
对细胞进行离心换液，并将细胞转移至新的培养瓶中，此时培养液中不许添加激活剂，只需要扩增因子，将密度重新调整为200万/ml
4 i# `' b; _  i% d5 r8 \) jD6-D17, j1 J; q! J/ h) f/ `
每隔两天计数并调整密度为200万/ml, l- K) y, V+ \8 X- Q5 s: U+ [
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7 A4 m5 a* g) G4 m" V* h收集细胞并表型检测。
  H" |  r$ ?% C/ P& A  d- a此技术取50毫升外周血培养17天能达到60亿细胞，纯度达70%左右。/ G6 p" t* [- |! |& r; y8 m
) ]9 @3 C2 z; D4 X* F
另外再分享一下开发NK工艺的经验
: m* V* s7 t, v4 N2 f7 `1、查看很多文献里面都是利用IL-2和IL-15或者再添加另外的白介素类因子去培养，本人验证了非常多次都无法实现，要么数量上不去，要么纯度上不去。' L! ~; y1 a# a( [0 r7 f9 t
2、另外很多文献选择利用磁珠分选的方法培养，这个方法的缺陷在于分选成本高，而且纯NK扩增慢，而且分选后所得起始细胞数太少，所以最后虽然纯度达到了，但是数量还是很难满足临床需求，要是用于科研的话另当别论了。: Y4 Q* z- w. g* R/ ?% e( Y
3、还有一个能在纯度和数量上都满足的培养工艺就是利用基因改造的K562细胞（在K562表面加入两个跨膜蛋白）做滋养细胞，培养半个月能扩增200倍的样子，但是好像这个工艺在临床上存在一定的伦理问题，毕竟滋养细胞本身就是癌变细胞，虽然在理论上是能用射线完全灭活K562，但是实际情况就不得而知了（此工艺我也做过）。1 P4 T! b0 c2 K( p
7 w) z& G: B! M& x
以上纯属个人在做NK培养工艺过程的一些想法。
4 k( s8 m: C6 l, X; O另外对NK培养提几点经验：
$ z. i& |! w' a+ y4 t" y1、个人觉得临床上还是用纯因子刺激的方法比较好，另外为什么只用纯粹的白介素类因子不能大量扩增，因为这些都不是很强烈的激活刺激剂，缺乏强有力的激活调动剂。这些白介素类因子在细胞活化后维持活性及扩增是没问题的，所以建议还在做优化的朋友可以考虑添加合适的刺激佐剂，具体的就不便透露了。" a/ \9 J2 `( O  u
2、培养基的选择也比较重要，同时也不是越贵越好
* e" @& u; @1 x3 I" i3、个人的经验来看NK的培养密度还是挺重要的，特别是接种密度，当接种密度低于200万/ml时扩增时间明显滞后，可能与个人工艺相关吧。
$ X) Q% c5 R- P/ A4、不同品牌的因子也比较重要，因为不同品牌的效价是不一样的，建议多尝试。

cg001

不错，这个对于NK细胞的培养是有指导意义

暖羊羊

回复 chenlin080102 的帖子
" {6 J9 R. J- m% J6 t1 y" t7 ]* U" B4 M# |. V- w; y/ q- o
楼主的意思是  不加扩增剂（基因改造的K562），只加刺激、扩增因子即可在17d达到扩增120倍的结果？这很好呀，可以弱弱的问扩增因子除了白介素类得还有什么吗？如果不方便说具体的，可以说功能，我们自己摸索，最近实验室也想尝试不用滋养细胞培养的方法。

chenlin080102

回复 暖羊羊 的帖子/ [. u/ ~( `1 I" z+ G: h  Z

1 E- H& S9 t8 O7 ^- L/ s可以选择添加一些临床用药作为刺激佐剂，跟免疫功能相关的药物

syj7888

NK细胞用白介素21刺激不是更好吗？不过需要太多，所以成本增加很多，太贵，所以才会用K562方法

lunyuyuanxj

曾经做过一组实验，纯度能达到50%以上，数量也不少，具体记不清了，但重复试验时效果不理想

yanglixia1984

什么是激活剂 什么是扩增剂？D3天只加了扩增剂，什么时候添加激活剂呢

chenlin080102

回复 syj7888 的帖子
$ }3 Q4 [% L  t9 R: f
( \0 \5 r! o, P尝试过IL21对NK培养的效果并不是很理想，单纯依靠这些白介素是很难在数量和纯度上都达到理想效果的，如果使用IL21的话生产成本就会很高。

chenlin080102

回复 lunyuyuanxj 的帖子* E1 B5 ?7 h- _; @/ ]* E: z
) n! E. W  q* N$ V  k3 Z
这应该是个体差异的个例吧

shellyanlanlan

学习了