个人关于NK细胞培养的经验分享及见解

chenlin080102

首先介绍一下本人自己的研究成果吧，目前能利用外周血来源PBMCs培养17天，扩增120倍，纯度（CD3-CD56+)达到70%左右。
! d) E$ n0 l" i7 Y大致培养过程：* e/ o6 d+ T' x; E6 i$ [
D0
0 V& C, J2 `3 G7 n+ e9 u用肝素钠抗凝的采血管采集外周血，按照常规方法分离及获取自体血清灭火冷冻备用；将细胞密度调整未200万/ml。
$ S/ A6 s* o: u& m3 H培养瓶可以选择用单抗提前包被过夜，也可以用溶解性单抗，再加入相应的刺激因子（包括激活剂）培养。. w& Y/ U' `* q' p5 F
D3
$ {* B4 ?1 X! X& ]. X对细胞进行离心换液，并将细胞转移至新的培养瓶中，此时培养液中不许添加激活剂，只需要扩增因子，将密度重新调整为200万/ml# {0 V" P& |( C0 @% N, |
D6-D17
/ }$ a9 r4 Z6 [每隔两天计数并调整密度为200万/ml8 g9 ], P. d& n% W
D177 y  S4 c8 ^. o" `- d* r* j# P' R
收集细胞并表型检测。) o; E. o6 u( z1 f& k+ w3 k
此技术取50毫升外周血培养17天能达到60亿细胞，纯度达70%左右。
  K- N1 h: K$ i0 {6 g
8 E" K; \! L( D另外再分享一下开发NK工艺的经验1 H- f1 v* }* }; \6 q9 X& N" ^
1、查看很多文献里面都是利用IL-2和IL-15或者再添加另外的白介素类因子去培养，本人验证了非常多次都无法实现，要么数量上不去，要么纯度上不去。: M; `9 x3 Y, [' h# n9 _8 h5 n
2、另外很多文献选择利用磁珠分选的方法培养，这个方法的缺陷在于分选成本高，而且纯NK扩增慢，而且分选后所得起始细胞数太少，所以最后虽然纯度达到了，但是数量还是很难满足临床需求，要是用于科研的话另当别论了。
1 Y$ q3 M6 i- r" m  y3、还有一个能在纯度和数量上都满足的培养工艺就是利用基因改造的K562细胞（在K562表面加入两个跨膜蛋白）做滋养细胞，培养半个月能扩增200倍的样子，但是好像这个工艺在临床上存在一定的伦理问题，毕竟滋养细胞本身就是癌变细胞，虽然在理论上是能用射线完全灭活K562，但是实际情况就不得而知了（此工艺我也做过）。' D. X: ]6 R; r0 C2 m" O8 S# ~& R' w

2 B4 @+ `0 r1 {" ]; q4 O' u- U1 L以上纯属个人在做NK培养工艺过程的一些想法。
5 U/ D& E- y1 E+ m. m/ z5 b2 {# n另外对NK培养提几点经验：
6 X  h3 z! f" p. W& B- p, E8 H1、个人觉得临床上还是用纯因子刺激的方法比较好，另外为什么只用纯粹的白介素类因子不能大量扩增，因为这些都不是很强烈的激活刺激剂，缺乏强有力的激活调动剂。这些白介素类因子在细胞活化后维持活性及扩增是没问题的，所以建议还在做优化的朋友可以考虑添加合适的刺激佐剂，具体的就不便透露了。- f+ `3 O+ c7 G) S' r
2、培养基的选择也比较重要，同时也不是越贵越好
% e1 ~' N+ ^. x2 R9 v. y3、个人的经验来看NK的培养密度还是挺重要的，特别是接种密度，当接种密度低于200万/ml时扩增时间明显滞后，可能与个人工艺相关吧。$ {5 a* J: T% u) I$ P2 ?
4、不同品牌的因子也比较重要，因为不同品牌的效价是不一样的，建议多尝试。

cg001

不错，这个对于NK细胞的培养是有指导意义

暖羊羊

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% W2 U' E8 j* `1 g  ^: J* z
) W# y# S: K3 ]* B% N; R0 Z楼主的意思是  不加扩增剂（基因改造的K562），只加刺激、扩增因子即可在17d达到扩增120倍的结果？这很好呀，可以弱弱的问扩增因子除了白介素类得还有什么吗？如果不方便说具体的，可以说功能，我们自己摸索，最近实验室也想尝试不用滋养细胞培养的方法。

chenlin080102

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1 J2 z3 O, e# o- r; g7 p, u4 Q/ _/ r6 V% ]9 O; l+ M
可以选择添加一些临床用药作为刺激佐剂，跟免疫功能相关的药物

syj7888

NK细胞用白介素21刺激不是更好吗？不过需要太多，所以成本增加很多，太贵，所以才会用K562方法

lunyuyuanxj

曾经做过一组实验，纯度能达到50%以上，数量也不少，具体记不清了，但重复试验时效果不理想

yanglixia1984

什么是激活剂 什么是扩增剂？D3天只加了扩增剂，什么时候添加激活剂呢

chenlin080102

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& M7 V8 L* F8 [) h" m0 }9 D: `! m5 A4 }
尝试过IL21对NK培养的效果并不是很理想，单纯依靠这些白介素是很难在数量和纯度上都达到理想效果的，如果使用IL21的话生产成本就会很高。

chenlin080102

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: ?' m+ p2 z) k# b, k$ r1 K2 n* X: ?& O6 N7 G. `5 @0 O/ `8 a+ H6 w8 i, M
这应该是个体差异的个例吧

shellyanlanlan

学习了