个人关于NK细胞培养的经验分享及见解

chenlin080102

首先介绍一下本人自己的研究成果吧，目前能利用外周血来源PBMCs培养17天，扩增120倍，纯度（CD3-CD56+)达到70%左右。
* F: {8 A7 y& z大致培养过程：
- E1 Q' M) K) a- U$ t1 ED0
- g+ U4 H% e8 l3 ^) P! n0 \用肝素钠抗凝的采血管采集外周血，按照常规方法分离及获取自体血清灭火冷冻备用；将细胞密度调整未200万/ml。
# Y  V. }1 C' ^2 x! s培养瓶可以选择用单抗提前包被过夜，也可以用溶解性单抗，再加入相应的刺激因子（包括激活剂）培养。3 t7 o3 d$ D& S% J) m' N  F
D3
' m) P4 W! B; S, r: A: F对细胞进行离心换液，并将细胞转移至新的培养瓶中，此时培养液中不许添加激活剂，只需要扩增因子，将密度重新调整为200万/ml
9 @$ X* B2 }0 Z/ {( f, j1 F/ ?D6-D17
2 ?: K+ d& @. D3 I( G6 i( D每隔两天计数并调整密度为200万/ml
3 }/ I. \; h+ W1 D9 E. ~; g, [6 v- ND17
# o: s% S2 ]* D+ d3 T6 f收集细胞并表型检测。
: p8 ]8 h- ~1 X此技术取50毫升外周血培养17天能达到60亿细胞，纯度达70%左右。
* @- @: g7 Z' G( t8 J: h6 H$ C( m8 y+ J! j
另外再分享一下开发NK工艺的经验
/ R' k* T$ Y$ J" J1、查看很多文献里面都是利用IL-2和IL-15或者再添加另外的白介素类因子去培养，本人验证了非常多次都无法实现，要么数量上不去，要么纯度上不去。
: {& [4 ?$ W1 u2 J; s2、另外很多文献选择利用磁珠分选的方法培养，这个方法的缺陷在于分选成本高，而且纯NK扩增慢，而且分选后所得起始细胞数太少，所以最后虽然纯度达到了，但是数量还是很难满足临床需求，要是用于科研的话另当别论了。
* B, u1 g+ B# ?4 a4 ?3、还有一个能在纯度和数量上都满足的培养工艺就是利用基因改造的K562细胞（在K562表面加入两个跨膜蛋白）做滋养细胞，培养半个月能扩增200倍的样子，但是好像这个工艺在临床上存在一定的伦理问题，毕竟滋养细胞本身就是癌变细胞，虽然在理论上是能用射线完全灭活K562，但是实际情况就不得而知了（此工艺我也做过）。6 F( k8 _" n5 Q! x) }% k4 e/ U7 b/ u$ k
8 y% I$ [& s# p& f* K
以上纯属个人在做NK培养工艺过程的一些想法。
. ~4 P" Z, Z! q4 t  P! P7 I; s. y' S另外对NK培养提几点经验：$ `2 F. a4 {6 q  V) {$ p2 F
1、个人觉得临床上还是用纯因子刺激的方法比较好，另外为什么只用纯粹的白介素类因子不能大量扩增，因为这些都不是很强烈的激活刺激剂，缺乏强有力的激活调动剂。这些白介素类因子在细胞活化后维持活性及扩增是没问题的，所以建议还在做优化的朋友可以考虑添加合适的刺激佐剂，具体的就不便透露了。
5 a5 j6 w9 O! ?$ g# W2、培养基的选择也比较重要，同时也不是越贵越好. ~3 r7 M/ W- o7 j6 C1 G) D
3、个人的经验来看NK的培养密度还是挺重要的，特别是接种密度，当接种密度低于200万/ml时扩增时间明显滞后，可能与个人工艺相关吧。
: {' N% }' w5 {0 A4、不同品牌的因子也比较重要，因为不同品牌的效价是不一样的，建议多尝试。

cg001

不错，这个对于NK细胞的培养是有指导意义

暖羊羊

回复 chenlin080102 的帖子& \) @6 t1 R8 ?2 C- p* v& x
; m% b$ t9 ?% ^/ U. @7 x
楼主的意思是  不加扩增剂（基因改造的K562），只加刺激、扩增因子即可在17d达到扩增120倍的结果？这很好呀，可以弱弱的问扩增因子除了白介素类得还有什么吗？如果不方便说具体的，可以说功能，我们自己摸索，最近实验室也想尝试不用滋养细胞培养的方法。

chenlin080102

回复 暖羊羊 的帖子
& }& y7 q5 o$ s) k& c$ J1 S) U
2 p# L- `) J( D' F, b可以选择添加一些临床用药作为刺激佐剂，跟免疫功能相关的药物

syj7888

NK细胞用白介素21刺激不是更好吗？不过需要太多，所以成本增加很多，太贵，所以才会用K562方法

lunyuyuanxj

曾经做过一组实验，纯度能达到50%以上，数量也不少，具体记不清了，但重复试验时效果不理想

yanglixia1984

什么是激活剂 什么是扩增剂？D3天只加了扩增剂，什么时候添加激活剂呢

chenlin080102

回复 syj7888 的帖子# U4 L. c, w" B5 O

* [0 T5 f: y& U9 s# D. x尝试过IL21对NK培养的效果并不是很理想，单纯依靠这些白介素是很难在数量和纯度上都达到理想效果的，如果使用IL21的话生产成本就会很高。

chenlin080102

回复 lunyuyuanxj 的帖子, x0 \. b7 p. _" X

* [' x9 I1 R' g' @0 U) h" t  b这应该是个体差异的个例吧

shellyanlanlan

学习了