个人关于NK细胞培养的经验分享及见解

chenlin080102

首先介绍一下本人自己的研究成果吧，目前能利用外周血来源PBMCs培养17天，扩增120倍，纯度（CD3-CD56+)达到70%左右。4 L% ^2 t, D& A/ @# a. o
大致培养过程：
1 f( P# y$ h; H) K8 ^0 W, C4 M. wD0, @' D- t. i8 l2 p2 W' E9 y* @
用肝素钠抗凝的采血管采集外周血，按照常规方法分离及获取自体血清灭火冷冻备用；将细胞密度调整未200万/ml。
( d" S* O+ r* `( T. j) W. ]培养瓶可以选择用单抗提前包被过夜，也可以用溶解性单抗，再加入相应的刺激因子（包括激活剂）培养。& D+ {; h2 ^. ^+ l" g6 A; U! S
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对细胞进行离心换液，并将细胞转移至新的培养瓶中，此时培养液中不许添加激活剂，只需要扩增因子，将密度重新调整为200万/ml
( O- ?6 V; x( w0 V  [D6-D17
/ |! R1 Q4 L# W1 U2 C- y. i每隔两天计数并调整密度为200万/ml
" e$ e- {3 o$ _. mD17
; z0 C! l. _3 I: z7 @- x收集细胞并表型检测。
$ \9 D8 L/ g1 H3 B3 N7 ^, |4 f此技术取50毫升外周血培养17天能达到60亿细胞，纯度达70%左右。; S9 i& O6 r/ r8 Q7 }# i' f4 g8 }

- D4 S8 x1 i) v, j, s另外再分享一下开发NK工艺的经验
' {/ g# o9 Q0 t% F$ \1、查看很多文献里面都是利用IL-2和IL-15或者再添加另外的白介素类因子去培养，本人验证了非常多次都无法实现，要么数量上不去，要么纯度上不去。2 X& H# ]; X2 t2 N& O) C
2、另外很多文献选择利用磁珠分选的方法培养，这个方法的缺陷在于分选成本高，而且纯NK扩增慢，而且分选后所得起始细胞数太少，所以最后虽然纯度达到了，但是数量还是很难满足临床需求，要是用于科研的话另当别论了。
9 J" w! j; e1 G, G" y3、还有一个能在纯度和数量上都满足的培养工艺就是利用基因改造的K562细胞（在K562表面加入两个跨膜蛋白）做滋养细胞，培养半个月能扩增200倍的样子，但是好像这个工艺在临床上存在一定的伦理问题，毕竟滋养细胞本身就是癌变细胞，虽然在理论上是能用射线完全灭活K562，但是实际情况就不得而知了（此工艺我也做过）。4 h. ?' k2 M  t7 B+ W# g6 ]  k3 r

8 W- e& U% q% r3 f! j以上纯属个人在做NK培养工艺过程的一些想法。
; `/ a8 n% w) W. y, a另外对NK培养提几点经验：+ y" q# D# y. W) q. p
1、个人觉得临床上还是用纯因子刺激的方法比较好，另外为什么只用纯粹的白介素类因子不能大量扩增，因为这些都不是很强烈的激活刺激剂，缺乏强有力的激活调动剂。这些白介素类因子在细胞活化后维持活性及扩增是没问题的，所以建议还在做优化的朋友可以考虑添加合适的刺激佐剂，具体的就不便透露了。
) E! a* I# E3 b# j& T/ }, N2 [6 L2、培养基的选择也比较重要，同时也不是越贵越好3 l. m# |$ ^- m; g; n$ ]3 n8 @: v
3、个人的经验来看NK的培养密度还是挺重要的，特别是接种密度，当接种密度低于200万/ml时扩增时间明显滞后，可能与个人工艺相关吧。% b0 F1 A5 Y3 @8 L
4、不同品牌的因子也比较重要，因为不同品牌的效价是不一样的，建议多尝试。

cg001

不错，这个对于NK细胞的培养是有指导意义

暖羊羊

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( G& ?/ B: W+ M: n1 w$ m
/ a$ V7 t9 c, |( u7 F楼主的意思是  不加扩增剂（基因改造的K562），只加刺激、扩增因子即可在17d达到扩增120倍的结果？这很好呀，可以弱弱的问扩增因子除了白介素类得还有什么吗？如果不方便说具体的，可以说功能，我们自己摸索，最近实验室也想尝试不用滋养细胞培养的方法。

chenlin080102

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  ?4 j0 ?1 A  o  c6 A: G
( ?7 c6 Z( R% L  m6 c7 \* @; J0 F9 S* f% u可以选择添加一些临床用药作为刺激佐剂，跟免疫功能相关的药物

syj7888

NK细胞用白介素21刺激不是更好吗？不过需要太多，所以成本增加很多，太贵，所以才会用K562方法

lunyuyuanxj

曾经做过一组实验，纯度能达到50%以上，数量也不少，具体记不清了，但重复试验时效果不理想

yanglixia1984

什么是激活剂 什么是扩增剂？D3天只加了扩增剂，什么时候添加激活剂呢

chenlin080102

回复 syj7888 的帖子# f! K9 C: }6 G, ~9 D, T4 u
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尝试过IL21对NK培养的效果并不是很理想，单纯依靠这些白介素是很难在数量和纯度上都达到理想效果的，如果使用IL21的话生产成本就会很高。

chenlin080102

回复 lunyuyuanxj 的帖子4 S  n  G/ I. P1 N' y
1 L1 ^0 E- q) ~& z4 {
这应该是个体差异的个例吧

shellyanlanlan

学习了