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首先介绍一下本人自己的研究成果吧，目前能利用外周血来源PBMCs培养17天，扩增120倍，纯度（CD3-CD56+)达到70%左右。/ J0 ]7 J" i# q3 O1 m3 k+ T
大致培养过程：9 n: V7 F5 d1 e( U( b: i
D04 k# r3 t" U( `+ M9 w7 a! S
用肝素钠抗凝的采血管采集外周血，按照常规方法分离及获取自体血清灭火冷冻备用；将细胞密度调整未200万/ml。
8 r4 B8 s) S6 X8 X6 q5 f0 h6 p培养瓶可以选择用单抗提前包被过夜，也可以用溶解性单抗，再加入相应的刺激因子（包括激活剂）培养。8 c" g) x) w" P/ c. K3 c2 |
D3
- G* F1 u0 n1 R5 _5 y4 A/ `对细胞进行离心换液，并将细胞转移至新的培养瓶中，此时培养液中不许添加激活剂，只需要扩增因子，将密度重新调整为200万/ml) [0 R# L. i1 | J8 }
D6-D17
+ \" W/ c- | Y+ |) m9 r3 L每隔两天计数并调整密度为200万/ml
' `2 H! W+ D9 o% {% Y: T) i4 jD17
% J. r* [1 m4 {0 Y' n; D收集细胞并表型检测。' F# B7 i+ N! i5 n1 y- e/ H) Z
此技术取50毫升外周血培养17天能达到60亿细胞，纯度达70%左右。, b* Y/ x1 ?8 h, k( H s; {- p9 C0 q
# W7 S% Y% h+ k" r' _( c: A5 _另外再分享一下开发NK工艺的经验
- O$ P0 S4 n: |# k1、查看很多文献里面都是利用IL-2和IL-15或者再添加另外的白介素类因子去培养，本人验证了非常多次都无法实现，要么数量上不去，要么纯度上不去。) ^0 r: ~6 p+ ?6 d/ S+ n, J
2、另外很多文献选择利用磁珠分选的方法培养，这个方法的缺陷在于分选成本高，而且纯NK扩增慢，而且分选后所得起始细胞数太少，所以最后虽然纯度达到了，但是数量还是很难满足临床需求，要是用于科研的话另当别论了。7 v/ _4 z7 V$ q: w
3、还有一个能在纯度和数量上都满足的培养工艺就是利用基因改造的K562细胞（在K562表面加入两个跨膜蛋白）做滋养细胞，培养半个月能扩增200倍的样子，但是好像这个工艺在临床上存在一定的伦理问题，毕竟滋养细胞本身就是癌变细胞，虽然在理论上是能用射线完全灭活K562，但是实际情况就不得而知了（此工艺我也做过）。 i3 p( C9 W' B( z
. T2 [# A0 ?) _4 x; K以上纯属个人在做NK培养工艺过程的一些想法。
; g& c6 C( m8 {- A3 g1 G/ J1 O$ X另外对NK培养提几点经验：( O9 g5 ~6 _9 N
1、个人觉得临床上还是用纯因子刺激的方法比较好，另外为什么只用纯粹的白介素类因子不能大量扩增，因为这些都不是很强烈的激活刺激剂，缺乏强有力的激活调动剂。这些白介素类因子在细胞活化后维持活性及扩增是没问题的，所以建议还在做优化的朋友可以考虑添加合适的刺激佐剂，具体的就不便透露了。
' L" r3 j% `# g2 u+ d% `2、培养基的选择也比较重要，同时也不是越贵越好! g( o6 B; k. [5 M$ K" ]
3、个人的经验来看NK的培养密度还是挺重要的，特别是接种密度，当接种密度低于200万/ml时扩增时间明显滞后，可能与个人工艺相关吧。
2 R. d& e3 J% G4、不同品牌的因子也比较重要，因为不同品牌的效价是不一样的，建议多尝试。 |
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发表于 2015-4-29 22:16
