|
- 积分
- 224
- 威望
- 224
- 包包
- 797
|
 
首先介绍一下本人自己的研究成果吧，目前能利用外周血来源PBMCs培养17天，扩增120倍，纯度（CD3-CD56+)达到70%左右。& Y" T5 m6 l% t; x) A2 \' O0 ~( U }7 i
大致培养过程：
- I; o- C2 C% c% B" o3 J! SD09 W- n s' S7 T3 L' ~3 y
用肝素钠抗凝的采血管采集外周血，按照常规方法分离及获取自体血清灭火冷冻备用；将细胞密度调整未200万/ml。
! l2 h+ O$ g3 `: v- N' L' I培养瓶可以选择用单抗提前包被过夜，也可以用溶解性单抗，再加入相应的刺激因子（包括激活剂）培养。
) o* F# {3 C! m, R8 H' }' F: g- M( tD3
( W$ G) [* [* ^5 V3 ~! F: X对细胞进行离心换液，并将细胞转移至新的培养瓶中，此时培养液中不许添加激活剂，只需要扩增因子，将密度重新调整为200万/ml& {7 e `% Y9 E/ j) c
D6-D17
' h/ X/ U }1 \9 K4 s每隔两天计数并调整密度为200万/ml/ v. D8 A+ e) b9 s, h0 {4 Q
D17
5 X; U0 A5 z) |. j+ J5 J3 E收集细胞并表型检测。
5 j) D- D# t" f L5 o* ]8 s此技术取50毫升外周血培养17天能达到60亿细胞，纯度达70%左右。
4 F/ V4 M. {7 a" z$ T$ n$ G5 Z! L& ]1 r6 v y
另外再分享一下开发NK工艺的经验
( A4 w2 A! H# b2 R* x" s2 G1 K1、查看很多文献里面都是利用IL-2和IL-15或者再添加另外的白介素类因子去培养，本人验证了非常多次都无法实现，要么数量上不去，要么纯度上不去。
3 G; ]; r1 r7 b1 L2、另外很多文献选择利用磁珠分选的方法培养，这个方法的缺陷在于分选成本高，而且纯NK扩增慢，而且分选后所得起始细胞数太少，所以最后虽然纯度达到了，但是数量还是很难满足临床需求，要是用于科研的话另当别论了。- a" f/ \# x# O7 h
3、还有一个能在纯度和数量上都满足的培养工艺就是利用基因改造的K562细胞（在K562表面加入两个跨膜蛋白）做滋养细胞，培养半个月能扩增200倍的样子，但是好像这个工艺在临床上存在一定的伦理问题，毕竟滋养细胞本身就是癌变细胞，虽然在理论上是能用射线完全灭活K562，但是实际情况就不得而知了（此工艺我也做过）。) k4 P8 x) \/ s* r$ e- u
( g* [& _4 a% F' H$ q- _
以上纯属个人在做NK培养工艺过程的一些想法。5 F0 w5 Q# x; T/ p
另外对NK培养提几点经验：
3 K1 J8 @' \, R; L; E8 r1、个人觉得临床上还是用纯因子刺激的方法比较好，另外为什么只用纯粹的白介素类因子不能大量扩增，因为这些都不是很强烈的激活刺激剂，缺乏强有力的激活调动剂。这些白介素类因子在细胞活化后维持活性及扩增是没问题的，所以建议还在做优化的朋友可以考虑添加合适的刺激佐剂，具体的就不便透露了。) m4 z+ X/ K: d! t N b. n9 c
2、培养基的选择也比较重要，同时也不是越贵越好 {6 }4 E/ t0 Y* @$ A$ c2 D
3、个人的经验来看NK的培养密度还是挺重要的，特别是接种密度，当接种密度低于200万/ml时扩增时间明显滞后，可能与个人工艺相关吧。$ r& r9 L' [& S: R
4、不同品牌的因子也比较重要，因为不同品牌的效价是不一样的，建议多尝试。 |
-
总评分: 威望 + 34
包包 + 60
查看全部评分
|
发表于 2015-4-29 22:16
