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首先介绍一下本人自己的研究成果吧，目前能利用外周血来源PBMCs培养17天，扩增120倍，纯度（CD3-CD56+)达到70%左右。
; o7 S9 m2 H. q; D大致培养过程：
. c& I3 k. p% J- UD00 l Q* A) T) f# B. H; P: [. \. O" b2 D
用肝素钠抗凝的采血管采集外周血，按照常规方法分离及获取自体血清灭火冷冻备用；将细胞密度调整未200万/ml。
5 P A0 v# p( [$ V培养瓶可以选择用单抗提前包被过夜，也可以用溶解性单抗，再加入相应的刺激因子（包括激活剂）培养。
( H% z: X- t3 W% qD3
: h: \* I2 j+ J5 m8 x- a对细胞进行离心换液，并将细胞转移至新的培养瓶中，此时培养液中不许添加激活剂，只需要扩增因子，将密度重新调整为200万/ml
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每隔两天计数并调整密度为200万/ml- f: _, ? L0 F0 y
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收集细胞并表型检测。
7 i& k( M' P' i, Q+ \+ s) U此技术取50毫升外周血培养17天能达到60亿细胞，纯度达70%左右。5 s* r) l; B( T! t* a
# j6 n+ ]; a) \8 @% n& `" ^另外再分享一下开发NK工艺的经验
8 R( W, f1 ]1 c' t# {" p1、查看很多文献里面都是利用IL-2和IL-15或者再添加另外的白介素类因子去培养，本人验证了非常多次都无法实现，要么数量上不去，要么纯度上不去。& D, n/ V& {$ O' P \( n
2、另外很多文献选择利用磁珠分选的方法培养，这个方法的缺陷在于分选成本高，而且纯NK扩增慢，而且分选后所得起始细胞数太少，所以最后虽然纯度达到了，但是数量还是很难满足临床需求，要是用于科研的话另当别论了。" e4 C) f$ r/ ]1 a; Y5 F
3、还有一个能在纯度和数量上都满足的培养工艺就是利用基因改造的K562细胞（在K562表面加入两个跨膜蛋白）做滋养细胞，培养半个月能扩增200倍的样子，但是好像这个工艺在临床上存在一定的伦理问题，毕竟滋养细胞本身就是癌变细胞，虽然在理论上是能用射线完全灭活K562，但是实际情况就不得而知了（此工艺我也做过）。, s$ M2 e l% P0 u2 z
' d4 |! `! n% F. J. g, Q. y/ L
以上纯属个人在做NK培养工艺过程的一些想法。
* J) R. ?# \. {* c1 H$ h: W) ?另外对NK培养提几点经验：6 Q$ V& R4 u) @* w; W$ P$ G! Y3 U
1、个人觉得临床上还是用纯因子刺激的方法比较好，另外为什么只用纯粹的白介素类因子不能大量扩增，因为这些都不是很强烈的激活刺激剂，缺乏强有力的激活调动剂。这些白介素类因子在细胞活化后维持活性及扩增是没问题的，所以建议还在做优化的朋友可以考虑添加合适的刺激佐剂，具体的就不便透露了。
6 g7 H/ |: x# O; o2、培养基的选择也比较重要，同时也不是越贵越好
6 ?' i! p; B: e3 M% I3、个人的经验来看NK的培养密度还是挺重要的，特别是接种密度，当接种密度低于200万/ml时扩增时间明显滞后，可能与个人工艺相关吧。# P( {" u3 r& m( R
4、不同品牌的因子也比较重要，因为不同品牌的效价是不一样的，建议多尝试。 |
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发表于 2015-4-29 22:16
