CIK细胞鲎试验（内毒素）检测

fsj1987

大家hi起来讨论一下鲎试验吧！自己提高也能服务新人

fsj1987

我先来踩点- f  z2 N3 R6 I/ x6 |% R! n
1、实验室物品准的准备8 y: l# z: g' o. L$ d$ I7 l
1.1        涡旋混匀器。; G+ k! P1 R: h7 l6 W* w
1.2        恒温水浴锅。& g3 A6 M- B0 i( o- q! C, S
1.3        鲎试剂（TAL）。' A% \; P/ j  N2 \' [0 G
1.4        细菌内毒素工作品（CSE）。4 d7 k6 `3 r8 [) q  A2 j1 Z, v3 V
1.5        细菌内毒素检查用水（BET），内毒素含量<0.015EU/ml。# }' o: \4 T+ |  I4 j
1.6        无热原试管。
4 S8 |# {. {( z- w: e! U* L1.7        无热原吸头（200ul，1000ul）。
: d) W6 U; \7 ^8 m8 q: j5 Z" @2、内毒素标准工作品溶液的配置
: I& X. z# [) Y- f4 E9 ~1 e2.1内毒素标准品溶液的配置$ S0 Z1 l8 H1 R: P
取细菌内毒素标准品1支，用酒精棉球消毒瓶颈，开启加检查用水1.0ml并混合15min备用。
. K' e3 M* M- X2 q( X内毒素标准品为10EU/支，鲎试剂标示灵敏度λ为0.125EU/ml时，内毒素阳性对照稀释至2λ，即0.25EU/ml。（注：横线上方表示取浓内毒素溶液的量，横线下方表示加检查用水的量。）
' Z0 W  b! e, d$ I4 @1 K5 c10EU/ml    1.0EU/ml     0.50EU/ml     0.25EU/ml! u0 r( O$ \9 ]& u3 Y$ x% G5 D/ `
2.2 供试品溶液的制备
0 r% N# b! W! ]( s5 k有效稀释倍数（MVD），按下公式计算：! w0 o9 S  r- D; ]* o5 n0 c
MVD=cl/λ* G7 G) q% I, M5 `0 i
式中L为供试品的细菌内毒素限值；c为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则c等于1.0ml/ml，当L以EU/mg或EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml；λ为鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml）。
, b4 {- W" C3 V( N! \& @' l% a4 ^如，细胞悬液其内毒素限值为2.0EU/ml，设所用鲎试剂的灵敏度为0.125EU/ml。
3 N) d) E! B: e7 Z+ R) F% yMVD=cL/λ=1×2.0/0.125=16（倍）
0 g6 |- l: R: K2 T取供试品0.125ml加检查用水1.875ml，混合均匀做内毒素检查用。
7 i% z: e( v* f: l2.3 供试品阳性对照液的制备
. V& G% t6 }$ A; D, @3 D" g分别取供试品的8倍稀释液0.5ml和0.50EU/ml的内毒素溶液0.5ml，混合均匀供检查用。" [- h: |# A/ M# J* r5 M
2.4 鲎试剂的准备& r: n0 u/ f+ y; _
根据供试品的数量，取鲎试剂0.1ml/支若干，按标示量加入检查用水复溶备用。
( g1 F/ x" _; H0 l0 n$ g试验加样见下表1。
' z% Y6 T/ b5 \" m  m表1供试品内毒素检查加样方法
7 q3 q* a) D# `' p* j: E. f( F  s/ Y
5 t% L" ^' T" W% P- D
测试组（A）        阴性对照        供阳组（B）        阳性对照5 u3 y7 D0 d7 Q
        1号，2号，3号…n        1号，2号，3号…n        1号，2号，3号…n        1号,2号/ v$ J' g) T1 O% X- R5 X! C
鲎试剂溶液        0.1        0.1        0.1        0.14 [6 Q! G. l" o
标本液        0.1                       
/ t9 j5 J+ [+ H' }+ l' G9 g- [# j检查用水                0.1               
( i1 N- |) h$ D* ]供阳性液                        0.1        / I. B- O; U; N+ _
阳性对照液                                0.1* K" J7 `$ E7 a* [) k7 l
2.5 检测$ C  u  a) v0 v- c1 t% I
加样完毕，将试管中溶液轻轻混匀后，转移至试管内，用封口膜密封管口，垂直放入37℃恒温水浴锅中，保温（60±2）min观察结果。0 u: c; u" C5 U# _
判读，时间截止将试管从恒温箱中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，未形成凝胶或形成的凝胶不坚实，变形并从管壁滑脱者为阴性（结果判读，当阳性对照都为阳性、供试品阳性对照都为阳性，且阴性对照都为阴性时，实验方有效）。
, K& I1 x" v4 }

fsj1987

今天做的内毒素阳性滑落，然后第二次做就没事，不知什么原因？你们都遇到过吗？

teahouse0802

我们在实际的细胞培养过程中也会出现假阳性的情况，一般出现假阳性之后都会做平行复检。我们的内毒素检测鲎试剂是不加检测用水的，直接向鲎试剂管中加入200微升待检样品，这可能和选用的鲎试剂品牌不同有关系。
- ^, [$ J  F* i7 k) z; f% e/ w4根管两根原来浓度，两根稀释8倍的，如果复检结果为4根管都为阴性，则判定之前的结果是假阳性。
/ i6 J4 L$ S. d: a* H如果复检结果未稀释的出现阳性，稀释8倍的表现阴性，而我们的内毒素限值是1.0，而鲎试剂的灵敏度为0.125，所以也判定为阴性。0 t" ~( k. U; ?' v) \6 d" `4 w/ h
如果4根复检管都是阳性则，则表示这份细胞不合格。

teahouse0802

回复 teahouse0802 的帖子! i( Q/ Y, P4 M/ ?; Z  z6 S8 e

1 d1 g( l, Z6 S+ {% o- b/ n补充一下，同种浓度出现相同的检测结果才算做有效。

colins

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: D, g8 h. u- L" T$ U4 a! A. h( r+ [* S7 J. f3 G
如果只是阳性管滑落的话，应该是你操作的时候动作幅度太大了，如果是干扰组滑落的话就应该检查你的干扰试验是不是做的合格。我偶尔碰到一些该凝胶的未凝的情况，结果复检都没事了，如果经常碰到的话就应该加强一下操作了。
0 Y# n' p( K6 e  O+ A2 ?2 U我觉得细胞类产品很难出现内毒素不合格，所以应该加强操作的熟练程度，我们把内毒素限值定在了0.5，很久都没见到阳性了

yingfeixiang

回复 fsj1987 的帖子8 D( i+ \! O7 x, x

' P2 ^0 r% v5 @是凝固状态后滑落的话，就是拿起看的时候剧烈碰撞了，我就又一次

baby00000003

有些个可以不通过凝胶滑落测量内毒素限度的机器
  o. k' D1 J5 B( P; w' n通过凝胶吸光度绘制标准曲线的方法定量测量

免疫与细胞

我们说待检样品，这个是不是太过宽泛了。对细胞培养来说，何时取样、取样样本类型、处理办法（比如需不需要离心）、内毒素检测阳性指标（100ml产品来说，其内毒素含量是低于1EU还是有其他标准），不知大家有什么看法。

细胞海洋

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