【讨论】骨髓间充质干细胞分离、培养及传代问题

lizhen

现在正在养猪和人的骨髓间充质干细胞，遇到一些问题，也查了园内一些资料，但是说法不一，在此提出请大家帮助：" q9 t+ O2 {1 W( O
7 _% k8 ~% S& z4 T. }1 a! b
1. MSCs用percoll法分离的时候，首次离心的时候转速需要多少，我用的是800g/30min，（我看有的是900g/15min，还有其它的，是不是根据物种有所不同）。离心的时候温度需要控制在多少，是室温还是4度，如果是室温，随着离心是不是温度会逐渐升高？& l& N3 {; C' B, @! o  t

7 \2 P. e8 \( j" J; b% Q6 P- E4 D2. 骨髓向Percoll分离液加样离心后，出现4层结构，然后是用吸管把上层的血清吸走在吸取单个核细胞层，还是直接把吸管伸进夜间吸取单个核细胞层？
' Q) S' t7 d" F7 L1 `2 R+ W* c) \+ J9 @# f1 n
3. MSCs传代的时候，终止消化吹打混匀后是需要离心还是直接分别接种到新的培养瓶中，有人说需要离心是洗掉EDTA，也有人说没有必要因为培养基中的Ca会与EDTA螯合使其失效，离心反而会伤害细胞，大家传代的时候用不用离心，参数如何?
" M) d  B7 l# r" |! X- {+ ~5 p, S8 k% Q+ L: y2 C/ f5 A
4. 人的MSCs与猪的分离方法有什么区别？我作猪的可以分离出厚厚的一层细胞，而人的采用相同的方法（只是percoll配的密度不一样）只有薄薄一层，不知道大家有什么经验？

wojoo

1）离心1000/5min/RT
" m% N1 [+ {: a  N! y1 q2)可以直接吸取
5 n/ @+ R7 p3 I3）应该离心，消化后液体中有酶和EDTA，必需去处

hbling2003

我分离人骨髓间质干时，首次离心为2000rpm/min,20min. 温度最好设置在20℃左右，吸取单个核细胞层时，直接将吸管插入到细胞层吸取，避免吸取到下面的粒细胞层和红细胞。传代的时候最好在低速下离心洗涤除去消化液，800—1000转/分

smartrabbit

我以2000rpm/min,20min离心，我们实验室的人传代时不离心，直接传代，细胞状态很好

gact

回复 lizhen 的帖子
! o1 M: V5 e5 _9 M: \- Y/ }' W* M, R9 T: ~* T% b* _- s
你在做猪的MSC么？; T6 k1 x. F) C
怎么采集骨髓的么？# _0 d2 ]4 ?9 B& N8 ~1 }
用什么型号的骨刺针？

hygene

3 f( `& q9 }/ P9 o& ]
: X$ R; L/ j! T% n
回复 lizhen 的帖子$ c0 y2 Z0 F( y( j% h! }9 f& H

* r# w8 o& R; p5 k1、离心1000g,10分钟，室温
& ~( x. R) L& M; X2、直接伸进去吸取单核细胞层
. q( V; K3 T0 K/ _" u  
" U  R& u2 L5 @! c' [4 U, `0 l5 Q3、不用离心（作猪BMSCs未离心传代20多次）
' a8 |4 h8 _: G" N( N4、从样品中分离的细胞量不一样

神经干

1首次离心用常温就可以了，我们之前分骨髓单个核细胞比较过4度和常温，差别不太大，离心时温度会逐渐升高的。5 |! o5 S4 B5 s1 |! d3 c
2以我的经验觉得先吸掉上清比较好，因为你不能保证在吸单个核时不吸到上层液体，如果熟练了可以直接吸的，看你个人了，这个应该没有什么硬性规定吧1 i8 ?" F& n4 ?2 t, P
3传代时以1000r离心，因为胰酶中可能含有损伤细胞的物质，影响细胞生长
) b- g3 f' p) G" g5 W3 @* P4猪的我没做过，不过不同的人的MSC的分离分出的白膜层也是不一样的

wangweilie0418

      我们做人的MSC，首次离心式r，25min，吸取白膜层的时候是直接取。不过我们的分离液用的是ficoll。至于传代时我们一直是离心的，这样可以去除残留的胰酶等对细胞生长没有帮助的杂志。

wangweilie0418

不好意思，首次离心式2500r，20min

RIVA2011

首先：2 G' X- S# @( q
我们是这样做的) U9 B1 M2 q" X4 ~, M
1. 首次离心的时候转速2000rpm  15min，传代离心1000rpm 离心的时候温度4度，至于是多少，我认为离心时间不长对细胞的影响不大。
3 X5 {2 S0 i. K, ~. d& N+ V& x8 P2. 至于用吸管把上层的血清吸走在吸取单个核细胞层，还是直接把吸管伸进液间吸取单个核细胞层，这不是关键，关键是不要吸到杂质细胞。/ e$ L2 J0 W" H( o! Q' f
3. 消化后，为了避免残留的胰酶等对细胞生长。我们要离心。
5 I& r- a! z* \/ o5 f: y