【讨论】骨髓间充质干细胞分离、培养及传代问题

lizhen

现在正在养猪和人的骨髓间充质干细胞，遇到一些问题，也查了园内一些资料，但是说法不一，在此提出请大家帮助：4 d3 O; n9 \" q$ T

" Z( T( i! T, i; @, n* }1. MSCs用percoll法分离的时候，首次离心的时候转速需要多少，我用的是800g/30min，（我看有的是900g/15min，还有其它的，是不是根据物种有所不同）。离心的时候温度需要控制在多少，是室温还是4度，如果是室温，随着离心是不是温度会逐渐升高？: t& p8 O# O$ d+ H0 _, k
4 ?" w( O8 o$ o+ \+ k
2. 骨髓向Percoll分离液加样离心后，出现4层结构，然后是用吸管把上层的血清吸走在吸取单个核细胞层，还是直接把吸管伸进夜间吸取单个核细胞层？6 r. ~! i2 j: ?9 U) u
! p/ G; o6 @0 u
3. MSCs传代的时候，终止消化吹打混匀后是需要离心还是直接分别接种到新的培养瓶中，有人说需要离心是洗掉EDTA，也有人说没有必要因为培养基中的Ca会与EDTA螯合使其失效，离心反而会伤害细胞，大家传代的时候用不用离心，参数如何?8 w. b( U$ t/ K' L. Y
* ~' `$ h4 f% A' _- @0 L7 z
4. 人的MSCs与猪的分离方法有什么区别？我作猪的可以分离出厚厚的一层细胞，而人的采用相同的方法（只是percoll配的密度不一样）只有薄薄一层，不知道大家有什么经验？

wojoo

1）离心1000/5min/RT
  H8 j" @! B4 c2)可以直接吸取
8 a/ z" {. t# d* E9 }, H7 l" P3）应该离心，消化后液体中有酶和EDTA，必需去处

hbling2003

我分离人骨髓间质干时，首次离心为2000rpm/min,20min. 温度最好设置在20℃左右，吸取单个核细胞层时，直接将吸管插入到细胞层吸取，避免吸取到下面的粒细胞层和红细胞。传代的时候最好在低速下离心洗涤除去消化液，800—1000转/分

smartrabbit

我以2000rpm/min,20min离心，我们实验室的人传代时不离心，直接传代，细胞状态很好

gact

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2 v, X* ~/ c" k0 L7 U7 x, h2 u7 q3 c4 E6 I( i+ O% d
你在做猪的MSC么？
* ?" u, r8 x- z$ e/ B- O怎么采集骨髓的么？
& l4 j9 \: f8 \; W, D用什么型号的骨刺针？

hygene

- v4 O4 t6 q, D2 S7 C" Z$ j" G- ~7 n
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回复 lizhen 的帖子& S4 L% M0 J% a) C: {4 Y( B& R
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1、离心1000g,10分钟，室温
3 J  Z9 y  H5 Z2、直接伸进去吸取单核细胞层
3 o) x' L% ?% s- v! e  
  |. [8 a1 w' T/ r) o2 N  A3、不用离心（作猪BMSCs未离心传代20多次）: B) s' y+ y$ S+ R# G  Z
4、从样品中分离的细胞量不一样

神经干

1首次离心用常温就可以了，我们之前分骨髓单个核细胞比较过4度和常温，差别不太大，离心时温度会逐渐升高的。
( r) ^. M+ \+ h" e* I* V# l2以我的经验觉得先吸掉上清比较好，因为你不能保证在吸单个核时不吸到上层液体，如果熟练了可以直接吸的，看你个人了，这个应该没有什么硬性规定吧) O& G5 V- a6 P4 S9 G0 n. Z" O
3传代时以1000r离心，因为胰酶中可能含有损伤细胞的物质，影响细胞生长/ k8 k2 R; b, c) b' a2 W
4猪的我没做过，不过不同的人的MSC的分离分出的白膜层也是不一样的

wangweilie0418

      我们做人的MSC，首次离心式r，25min，吸取白膜层的时候是直接取。不过我们的分离液用的是ficoll。至于传代时我们一直是离心的，这样可以去除残留的胰酶等对细胞生长没有帮助的杂志。

wangweilie0418

不好意思，首次离心式2500r，20min

RIVA2011

首先：
( T. S) a& y. P) X# h我们是这样做的- A3 A: O# L+ G% N% u" ?
1. 首次离心的时候转速2000rpm  15min，传代离心1000rpm 离心的时候温度4度，至于是多少，我认为离心时间不长对细胞的影响不大。- O8 y1 I* p+ f, v6 C5 G& j  X
2. 至于用吸管把上层的血清吸走在吸取单个核细胞层，还是直接把吸管伸进液间吸取单个核细胞层，这不是关键，关键是不要吸到杂质细胞。
/ ^! b) N% i: S' @% J3. 消化后，为了避免残留的胰酶等对细胞生长。我们要离心。9 s5 t0 {! [) X5 {