荧光原位杂交（fish）探针设计原则和方法

l19rna

$ O+ H, P0 q8 F2 L/ k+ K/ H- H& i' @% |$ V8 h7 L' J
最近要做FISH，但是不会设计探针，打算用cRNA探针制备法，但是探针序列选择上不是很明白，比如Oct4的mRNA探针要怎么设计比较好？' v/ ?6 X& n, Z7 e% Y5 }

/ U, ], t3 b0 _看了个探针设计帖子，对新手来说，理解得不是很明白。
/ W& I* X1 p, W" k3 d0 p不知道是否有探针数据库可以查询？
/ T+ p" [) R& m7 m( V" J- \
1 U5 i6 Z  e/ y自己设计的话，长度（~600bp），特异性（3‘UTR或5’UTR？）怎么把握比较好？
' v3 N; M% S2 j: H! p+ R' C5 `
2 e, I0 J+ C9 X6 f$ O- n- s, f求高人指导~( x/ K( k5 n9 d7 E6 T

妖妖空

NCBI不行吗？

l19rna

回复 妖妖空 的帖子' ^& O% @* a8 C
) @/ a' a2 F0 D
可以啊，最近脑子短路了~就用平常的引物设计软件就行

weiyepan

7 y: j1 B( t. _6 E7 }  Z
! i/ h6 Q) U2 r- l2 C1 C, N- i( H
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相对特异性会差点。但是你做mRNA的话，看你想做RNA探针还是DNA探针，感觉RNA探针会好用很多，背景会低点。; N' f- X+ y' j4 y% D! v
用RNA探针的好处就是转录效率高，得率也高，掺入比例比DNA探针要高，可以用RNAse H降低背景。缺点是容易降解，如果是现做现用，应该没问题，如果要保存超过两星期，那就有点麻烦了。
9 H0 n$ ~3 I: r+ r8 q- s. F- `# |上传一篇protocol，做RNA探针的，你把里面aa-UTP换成你要标的荧光UTP就行了。- R. F( G6 Z4 O7 ?6 G( w
standard protocol of T7 aa-RNA transcription.pdf (53.03 KB)

2012-7-16 21:30 上传

请用IE浏览器下载
下载积分: 威望 -2 , 包包 -5

l19rna

回复 weiyepan 的帖子: H% g1 b* e1 F6 B

9 \, M* U$ }8 j5 \果然是高手，嗯，谢谢啦。我要做cRNA探针呢，要做胚胎的Fish

kkmmkkmmkk

weiyepan 发表于 2012-7-16 21:27 " A3 i/ l1 |/ g; c
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相 ...

$ u9 B# V% `5 ]' v: ?% l+ a; p/ P- u附件下不了！包包不够啊！怎么样速度赚取包包啊？

细胞海洋

回复 kkmmkkmmkk 的帖子+ u" Z, r( X' N  J; L" [0 {
7 t# X, l4 d! H5 G
参与讨论 获得积分

s1002297748

给力

huangxf1998

在INVITRIGEN购买TA克隆的plasmid,照着说明书做。, n4 a4 x. O3 _; r
TA克隆的plasmid应该是最好用的，也最简单。
4 c! q" I% w  m5 ?几点注意：2 F& H. u% t# R! y: Y: M
1.一次多选几个不同的片段，因为不是每个选取的片段都能成功，原因我也不知道，经验而已。  |$ O: n, ?( j' u
2.注意RNA酶的污染，一定要保持无RNA酶操作。
4 n% y6 i* w0 r" O( H- h3 `3.长度有时候不是最重要的，我做过1kb的，照样成功，但是成功率比较低。但是你的600bp应该没问题。: Q9 x  L3 n! A, f( P2 t2 ]
4.多探索，不要怕失败。第一次做就当练手，别太当回事。5 G, p% x* @) J( ~9 @* J, q

l19rna

回复 huangxf1998 的帖子
0 O- K  _8 e/ M' V  y* v
. f( `; x- `, t2 N. ~( M第一次已经失败了啊，唉，呵呵