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不同细胞接种浓度影响人脐带间充质干细胞生长及多向分化
# h. i& S0 O" |5 n9 ~- z5 L. N李 辛，刁 克，张凤香，孙大鹏
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% m8 I1 f+ N2 |0 u9 w. c材料： 脐带：足月剖宫产胎儿脐带由锦州凌河区妇幼保健 院提供，脐带取自足月新生儿，均经父母授权同意。孕 妇无传染性疾病，产妇及家属对脐带用于实验研究均知 情同意。 试剂和仪器： 2 J; D" [, {2 k# T( |/ E
方法： 人脐带MSCs的原代培养：无菌条件下取脐带， D-Hank’s平衡液充分洗涤残留的血液，去除脐静脉、脐 动脉及脐带外膜，剥离Wharton胶，并将其剪碎至1 mm× 1 mm×1 mm大小组织块。将组织块移至1 g/L的胶原酶Ⅱ 中，加入少许DMEM，在37 ℃恒温震荡仪内消化，直至 Wharton胶全部消化。将含细胞的消化液吸入无菌离心 管，以30倍体积的DMEM反复吹打稀释，1 500 r/min离 心10 min，弃上清液，用含体积分数15%胎牛血清的 DMEM/F12培养基清洗，使细胞悬液均匀分布，转移至 普通培养瓶中，以5×104，1×105，5×105，1×106， 3×106/cm2的浓度接种，在37 ℃、体积分数5%CO2培 养箱内培养。细胞贴壁后第3天首次半量换液，弃去未 贴壁细胞，以后每三四天换液1次。倒置相差显微镜下 观察。细胞达80%融合后，2.5 g/L胰酶消化，按 1 2~1 3 ∶∶的比例传代，续扩增培养。于倒置显微镜 下观察细胞形态并拍照。 细胞表型测定：于24孔培养板内放置无菌盖玻片，取 第2代细胞1 mL，按1×108 L-1接种。待细胞呈融合状态 时，取出盖玻片，PBS洗3次，40 g/L多聚甲醛固定 30 min，而后按试剂盒说明进行免疫细胞化学染色，一 抗为抗CD166、CD44、血管性血友病因子抗体， 1∶100 稀释，湿盒内4 ℃过夜。隔天PBS冲洗3次，加入辣根 过氧化酶标记的二抗，1∶200稀释，37 ℃孵育2 h后， PBS洗涤3次，SABC显色试剂盒显色，显微镜下观察。 诱导分化检测： 成神经诱导：取第1代人脐带MSCs，以1×104/cm2 浓度接种于加入盖玻片的24孔培养板中，以含20 μg/L 碱性成纤维细胞因子、体积分数10%胎牛血清的 L-DMEM培养基培养，细胞进入对数生长期后将培养基 更换为含有4 mol/L β-巯基乙醇的培养基中进行诱导培 养，每隔1 h镜下观察细胞形态变化，诱导6 h。对照组 加不含诱导剂的培养基。 诱导6 h后取出细胞爬片，0.01 mol/L PBS洗3遍，每次5 min，以4 g/L多聚甲醛固定30 min，体积分数 3%H2O2与甲醇混合液室温下作用10 min后，体积分数 10%山羊血清封闭20 min，吸去多余的液体，分别行抗 Nestin、神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白免疫细胞化学 染色。一抗分别为1∶200稀释的兔抗大鼠Nestin、神经 丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白抗体，4 ℃过夜。二抗为 1 400 ∶ 的生物素化羊抗兔IgG，37 ℃温育30 min，三抗 SABC 37 ℃温育30 min，DAB显色，苏木精复染，盐 酸乙醇分化，脱水，透明，封固。镜下观察并拍照。每 种染色分别随机选取5张玻片，每张取5个不重复的视野 计数神经元样阳性染色细胞，计算其占总细胞数的百分 比，取平均值。 成胰岛诱导：取第1代人脐带MSCs，经消化后以浓度 1×107 L-1接种于6孔板中，细胞达80%融合时更换诱导培养 液，按诱导培养液成分不同分4组：NA组(含10 mmol/L尼 克酰胺，10 μg/L活化素A)、NG组(含10 mmol/L尼克酰胺， 10 nmol/L胰高血糖素样肽1)、AG组(10 μg/L活化素A， 10 nmol/L胰高血糖素样肽1)；NAG(含10 mmol/L尼克 酰胺，10 μg/L活化素A，10 nmol/L胰高血糖素样肽1)， 在诱导第1~7天，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基，第8~21天，用含体积分数10%胎牛血清的 DMEM低糖培养基，37 ℃、体积分数5%CO2、饱和湿 度条件下培养，3 d换液1次。将诱导第21天的细胞行双 硫腙染色，用100 mg/L的双硫腙溶液37 ℃孵育15 min， 拍照。 成脂诱导：取第1代人脐带MSCs，经消化后以1× 107 L-1接种于6孔板中，每孔中加入3 mL含有1 μmol/L地 塞米松、10 mg/L胰岛素、0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲 基黄嘌呤和100 μmol/L的吲哚镁辛的成脂诱导培养基， 常规换液，3周后取出细胞爬片，PBS洗2次，40 g/L多 聚甲醛固定30 min，油红O染色15 min，体积分数60% 异丙醇分色至背景无色。 主要观察指标：不同浓度接种细胞的原代培养及多 向分化情况。 统计学分析：所有数据均用x _ ±s表示，用SPSS 13.0 软件，采用单因素方差分析进行数据处理，P < 0.05为 差异有显著性意义。 2 结果 ! l$ R( B. L4 Q/ {5 Z
2.1 不同浓度接种细胞的原代培养时间 原代培养结 果显示，接种浓度为3×106/cm2组的原代培养时间为 (11.0±2.1) d，1×106/cm2组为(12.5±1.2) d，5×105/cm2 组为(13.4±3.5) d，1×105/cm2 组为(22.9±1.4) d， 5×104/cm2组仅有1瓶有细胞贴壁呈克隆样生长，但24 d 时仍不能传代，其余培养瓶无细胞生长。经统计学比较， 前3组培养时间差异无显著性意义(P > 0.05)。说明以5×105~1×106/cm2细胞浓度接种的人脐带MSCs生长状 态佳。 2.2 分离培养的细胞的形态及表型 显微镜下观察发 现，接种的细胞6 h后开始贴壁，24 h后有部分细胞贴壁， 48 h后细胞完全贴壁生长，可见呈椭圆形、多角形的内 皮细胞及梭形成纤维样细胞，有的形成漩涡状生长的集 落。传代培养2 h细胞开始贴壁，24 h基本完成贴壁，传 代七八天长满瓶底，见图1。 - |. Q9 Q7 r/ W( L1 n
免疫细胞化学染色显示，细胞表面抗原CD44、 CD166阳性，而血管性血友病因子阴性。说明所得细胞 具有MSCs的特点，见图2。
, @4 q. b& t& S5 |! Q0 C2.3 人脐带MSCs向成神经元样细胞的分化 倒置显 微镜下观察，诱导3~6 h，人脐带MSCs形态变化明显， 细胞向细胞核收缩，细胞变短，体积变小，部分细胞的 细胞质收缩形成细胞突起。用生长因子维持诱导，细胞 突起进一步延长和变细，折光性好，局部区域相邻细胞 突起连成网状，部分细胞呈现典的神经元样细胞形态。 也有少量细胞分化后体积较大、突起小而多、较少聚集，可能是胶质样细胞，还有少数细胞形态无变化，至正式 诱导6 h，神经元样细胞明显增多。各细胞间紧密相连， 形成网络样结构，见图3。
2 z: u# J' w- m! ^随着诱导时间的延长细胞死 亡增多，超过24 h，细胞全部死亡，漂浮于培养液中。5 }) d5 B1 u2 `# f: V
免疫细胞染色鉴定结果显示，诱导6 h后的细胞中 可见胞浆呈棕黄色的Nestin、神经丝蛋白、胶质纤维酸 性蛋白的表达，见图4。
+ T1 s [7 d4 C% f2 z. T3 Z. `2.4 人脐带MSCs向成胰岛样细胞的分化 诱导第7天，长梭形细胞突起变短，逐渐变为鹅卵石样，14 d时， AG、NAG组细胞近圆形，细胞折光性增强，有细胞团 样结构出现，见图5a；21 d时，NAG组形成了明显的呈 半悬浮状态的胰岛样细胞团，见图5b。NA、NG组细胞 形态改变不明显。* Q J4 ~; F' a- e3 |8 D
双硫腙染色显示，21 d时，NAG组细胞形成了胰岛 样细胞团，并且呈砖红色阳性表达，而NA、NG、AG 组没能形成明显的阳性细胞团，见图6。+ y$ }% Q% y- g( S* B& _! U
2.5 人脐带MSCs向成脂肪样细胞的分化 人脐带 MSCs经成脂诱导培养基诱导后，可见少量细胞油红染 色阳性，有明显脂滴出现，因此人脐带MSCs具有向脂 肪细胞分化的潜能，见图7。
4 W, S U8 D9 d3 讨论 ! S( z, w8 j. ?2 Q) G/ g* d/ k8 M
人脐带MSCs是一种从脐带Wharton's jelly中分离 出的新型干细胞[7]，适合同种和异种移植，具有较强的 自我复制能力和多向分化潜能，在体外能够被诱导分化 为心肌样细胞及生殖细胞[8-9]。近年来，国内外学者对人 脐带MSCs进行研究并取得了一定成果。有研究表明， 脐带中富含干细胞，平均每厘米脐带组织中含有4×105 个，远远高于骨髓中的含量。脐带MSCs有望取代骨髓 MSCs成为组织工程中更为理想的种子细胞。实验结果 表明，原代分离培养中，种植细胞浓度为5×105~ 1×106/cm2的方法较合理。可能是因为虽然用D-Hank’s 平衡液充分洗涤残留的血液，去除脐静脉、脐动脉及脐 带外膜，但仍混有血细胞，当高浓度接种时浓度较大的 红细胞先沉于瓶底，从而减少了MSCs的贴壁面积，同 时细胞代谢废物和死细胞也明显增加，因此浓度大于 3×106/cm2并不能缩短MSCs培养时间；当接种浓度过低 时，MSCs细胞贴壁明显减少，从而延长培养时间。因 此，合理的接种浓度为获得生长性状稳定、增殖速度快、 贴壁时间短、贴壁细胞成活率高的MSCs细胞起到了重 要的作用。 有研究表明MSCs具有向胰岛细胞分化的潜能[10]。 实验成功将人脐带MSCs诱导分化为胰岛样细胞，并未使用可能会被细胞吸收而再分泌的胰岛素[11]，而应用尼 克酰胺、活化素A和胰高血糖素样肽1形成的微环境。研 究发现，尼克酰胺可以减轻胰岛素依赖性糖尿病患者的 危险度[12]。尼克酰胺能促使体外培养的干细胞向胰岛细胞 分化，增加胰岛细胞分化的数量，促进分化的细胞成熟， 加快胰岛细胞团的形成，增强胰岛细胞团的功能[13]。但尼 克酰胺诱导干细胞向胰岛β细胞分化的具体机制还不清 楚，可能与其在诱导过程中可以保证细胞不至于凋亡或者 向其他方向分化有关[14]。而活化素A和胰高血糖素样肽1 则有助于β细胞分化[15-16]。实验应用尼克酰胺、活化素A 和胰高血糖素样肽1几种生长因子形成的微环境。诱导第7 天，就可见长梭形细胞突起变短，逐渐变为鹅卵石样， 14 d时AG、NAG组细胞近圆形，折光性增强，21 d时， NAG组形成了明显的呈半悬浮状态的胰岛样细胞团，且 双硫腙染色阳性，说明其胞浆富含锌离子，与β细胞相似。 近年来，骨髓源和脐血源MSCs显示出良好的神经分 化潜能[17-21]。关于脐带MSCs的研究并不多见，其分化潜 能是否有别于骨髓MSCs和脐血MSCs，能否实现向神经 细胞方向高效地诱导分化尚无肯定结论。Nestin为神经元 及神经胶质共同的前体细胞专一性标记物，Jeong等[22] 研究表明脐带MSCs培养前后均能表达一些神经元标记 物。实验结果显示，脐带MSCs经诱导后，细胞体积缩小， 伸出突起，呈现出典型的神经元样细胞形态。免疫细胞 化学染色显示细胞表达Nestin、神经丝蛋白及胶质纤维酸 性蛋白，因此脐带MSCs具有成神经分化能力。 此外，实验还通过成脂诱导培养基诱导，油红O染 色阳性，且可见有明显脂滴出现。说明人脐带MSCs在 体外具有向脂肪细胞分化的潜能。 总之，人脐带MSCs来源广泛、容易获取、免疫原 性低、增殖分化能力强，恰当的人脐带MSCs培养方法， 可以快速获得最大量的自体种子细胞，并可在一定的诱 导条件下向神经元样、胰岛样、脂肪样细胞分化。因此， 脐带MSCs可能是未来各系统疾病细胞治疗及基因治疗 最具潜力的种子细胞[23-24]。 " V2 r" y b3 i6 B, \
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发表于 2016-9-13 09:59
