请问体转干的四个转录因子在细胞质中存在吗？

ghfvcat

时间太短？照片呢，传上来看看啊

胡鹏飞

孵育了两个小时，细胞核里面没有，只在核周围聚集着

msliyv

再仔细看了看这几篇文章，采用代tag的融合蛋白导入确实不失为一个方法，如果先不考虑tag本身的影响的话。
- T2 n! L! Q: M6 `" R+ K3 p5 V' p5 w' i* U# P+ v0 |  _
Ding的文章用的也是原核表达系统，如果他能做出来，那么证明原核表达应该不是问题，或者说对这四个因子来讲转译后修饰并不是活性所需要的。
1 i/ e; g! T, u. ]: z0 W( P6 C! ?( F; C, Z* Y
楼主发现蛋白只在核膜周围不进核可以考虑一下蛋白降解和蛋白错误导向的可能性。同时用细胞器染料看看
: c1 f4 w: V) e5 U  n6 B具体是在什么compartment，比如Golgi，rER，endosome，还是lysosome等。这需要用到Confocal microscope 或者EM

胡鹏飞

我用共聚焦照的，可以肯定都在细胞核周围，别的地方荧光几乎没有，难道是蛋白降解了，还是蛋白的核定位序列没暴露出来呢？我纯化的蛋白是表达的可溶蛋白，不是包涵体，做过一次包涵体的纯化，但是连细胞膜都没进去

胡鹏飞

我用共聚焦照的，可以肯定都在细胞核周围，别的地方荧光几乎没有，难道是蛋白降解了，还是蛋白的核定位序列没暴露出来呢？我纯化的蛋白是表达的可溶蛋白，不是包涵体，做过一次包涵体的纯化，但是连细胞膜都没进去

胡鹏飞

我还想问一下：我的包涵体透析后都是絮状的，透析液是含10%甘油的PBS，怎么将絮状的包涵体溶解后加入细胞培养液中呢？

胡鹏飞

我表达的可溶蛋白透析后正常，但是进不到细胞核

ghfvcat

回复 15# 胡鹏飞 ' d. ?5 o" b3 a- |1 f& I

& g5 n0 u' F* W! K7 O: Z0 I/ H1 Y
    我觉得尽量避免包涵体表达然后复性，本来活性就没法检测，复性后就更不好说了，加长孵化时间看看

胡鹏飞

孵育了12小时仍然进不到细胞核

zlightmiss

回复 10# 胡鹏飞
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    可能表达出来的蛋白的三维结构不正确吧....