iPS诱导过程中感染效率很低的问题（附图）

jason

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" z8 K1 Q1 |( l; L0 \
我用pMX-GFP载体转染Plat E后荧光表达还是很强的，但是48小时候收病毒感染MEF细胞却看不到荧光，或者荧光很弱。开始以为是plat E或者polybrene的问题，后来将这些都换了一批新的，但仍然效果不好。请大家帮忙分析一下到底什么原因导致感染效率低下。附上两张图片：转染后24h的plat E和感染后72h的MEF.
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liulilin

关于提高转染感染效率问题请看 下面这篇文献

lingren

对照与目的基因载体肯定会有差别啊，看你载体是怎么构建的，GFP发光说明载体序列没遗码，是正确的，另外，你是将四个基因构建在一个载体上了？载体过大当然会影响效率，慢病毒就存在这个问题，逆转录病毒应该也是这样，建议四个分别包装！
. W2 I' k* L: B8 d1 L2 ~" _0 {: p滴度问题你也没有提及，在细胞可承受范围内提高滴度嘛！楼主自己要先分析，再把问题写详细！

jason

病毒滴度我没测，我是直接收集上清感染mef细胞。我就觉得奇怪，为什么转染效率还可以而感染很差，如果真是病毒滴度太低，那么包装环节出什么问题了吗？我是按protocol标准操作啊！
/ F8 A; s' E5 Q$ R. a2 Q) J   pMX-GFP在这里只是做一个阳性对照，观察转染和感染过程有没有问题。对于那四个因子，是分别包装的。现在对照都有问题，四因子感染当然没法做。

上海过客

换个 293T 细胞试试 ？ 容易感染的试试 ？8 }; Y( D% {5 q/ r7 F6 H

8 f# _# n8 J$ t  z8 X说不定是 MEF的问题 ？ MEF 是第几代的 ？  有没有测支原体是否污染？

饶冠华

有没有明场照片？计算过感染比例吗？看下面那张照片里还是有蛮多细胞感染上GFP了啊  只不过表达不是很强。包装可能没什么问题，可能跟靶细胞有关系。另外楼上说的用293T做靶细胞去试试是不可行的，因为293T是属于人源的，而plat-e包装出来的病毒不能感染人源的细胞，一般只针对鼠源细胞

大刀无敌

你病毒是怎么用的 原液还是浓缩液  感染细胞数量 怎么样  感染后几天发的照片

上海过客

有没有明场照片？计算过感染比例吗？看下面那张照片里还是有蛮多细胞感染上GFP了啊  只不过表达不是很强。包 ...
5 Q8 x4 o9 K* W/ {3 L' X3 [' p饶冠华 发表于 2010-5-28 14:12

) _, x# Q' d8 W- c% f( g. C- v8 B8 Z7 Y% i$ H4 g# h6 ~
能否 确认 ？  好像 PLAT-E 就是 从293T细胞得到的

饶冠华

回复 8# 上海过客 3 D8 R' W. s$ g1 t3 m) n

% P0 E0 t1 T# _3 ^/ j5 \逆转录病毒包装细胞系：单嗜性（Ecotropic）Plat-E包装细胞系、双嗜性（Amphotropic）Plat-A包装细胞系及泛嗜性（Pantropic）Plat-GP包装细胞系。它们对不同的细胞具有不同的侵染性。$ |% C" p4 w+ m  K" y0 \5 O, H* W$ k
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Plat-E包装细胞系（Ecotropic）是一种来源于人胚肾(Human Embryonic Kidney, HEK)293细胞系,主要用于快速、短暂地产生高滴度逆转录病毒，同时也能用于稳定地产生逆转录病毒。由Plat-E包装细胞系产生的病毒表达一种单嗜性的被膜，因而只能感染小鼠和大鼠细胞。Plat-A包装细胞系（Amphotropic）也是一种来源于HEK293细胞的细胞，在将病毒env 基因导入该细胞时利用嘌呤霉素作为选择标记，因而对于一些使用嘌呤霉素作为筛选标记的载体无法使用。Plat-GP包装细胞系（Pantropic）也来源于HEK293，但却是一种泛嗜性的包装细胞系，其包装产生的逆转录病毒颗粒既能感染哺乳动物细胞，也能感染非哺乳动物细胞。在使用过程中, Plat-GP细胞需要用逆转录病毒载体和pVSV-G来共转染。VSV-G是泡状口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus) 的被膜糖蛋白，能通过脂质结合及质膜融合来介导病毒进入细胞。因此在使用Plat-GP细胞系时，还需要额外的使用pVSV-G完成包装。

xyzengh

从MEF的感染情况来看，效率并不低，应该足以用于重编程，另外反复感染有利于提高高燃效率，丁香园上有两个帖子也许有些经验值得你借鉴，祝好运。# R7 U" Q( o" J8 S3 ]- b& F6 z
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=76&id=17082882&sty=1. p$ W7 P# M+ X* \
http://stemcell.dxy.cn/bbs/post/ ... amp;tpg=3&age=0