关于用MEF做ES/iPS细胞鉴定的隐性对照问题。请看山中伸弥教授06年文章图片。

刘实

希望上海过客打破沙锅问到底，最终是会水落石出的。

ambassador

这篇文献的  WESTERN 的 结果。 可以对照 RT-PCR 的 结果 。  OCT3/4,Sox2,基因 RT结果 iPS 与ES 基因差别较 ...9 P( \3 b* \* b* e
上海过客 发表于 2010-7-2 08:10

. _5 w# H" O5 j: ~8 G& k2 H$ G+ k3 r$ D* }% D
       强度上来说加40ul应该没有问题！蛋白含量在实验前都是经过严格标准化的！
- z; N. g2 S% B+ g8 e( n2 u- I! B. W3 R+ ?3 d
     western 是蛋白印迹，当然用β-actin这种蛋白，而RT-PCR检测的是DNA序列，用的是nat1基因序列，有什么疑问吗？内标只是一个参照。
" R8 S4 p  |$ A     RT-PCR中，在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。 . B1 \  i) O0 g' u7 e& p
     west中，一般内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。选择β-actin肯定是为了更好的分离出其他蛋白的缘故。内参的稳定，是以一个细胞为基本单位，也就是在刺激下，各个细胞的内参量是基本相同，在其他蛋白变化的同时，也不随刺激变化。所以作为参照物。

ambassador

这个 也不是太懂，今天才搞懂 ，  山中文章图片里最后一栏 的 RT-MInus  就是 直接用RNA样品来做 PCR 以 ...9 W0 ~3 e  E9 P2 Y
上海过客 发表于 2010-7-1 16:28

  J2 [  Y9 v- q4 n' R/ @( J5 A
# b% R: l0 a; Q# r) A4 `- }! D1 E: e' Y& h
    minus就是缺失的意思，应该是这么解释。我查看了下原始文献，摘录一段给大家参考（666页左下段）：
0 A' ?, n# H+ m5 J4 Y  b: y% C  t% f$ I: h
No combination of two factors could induce the formation of G418-resistant colonies (Figure 2C). Two combinations of three factors—Oct3/4, Sox2, and c-Myc (minus Klf4) or Klf4, Sox2, and c-Myc (minus Oct3/4)—generated a single, small colony in each case, but these could not be maintained in culture. With the combination of Oct3/4,Klf4, and Sox2 (minus c-Myc), we observed the formation of 36 G418-resistant colonies, which, however, exhibited a flat, non-ES-cell-like morphology. With the combination of Oct3/4, Klf4, and c-Myc (minus Sox2), we observed the formation of 54 G418-resistant colonies, of which we picked 6. Although all 6 clones could be maintained over several passages, the morphology of these cells (iPS-MEF3) differed from that of iPS-MEF4 and iPS-MEF10 cells, with iPS-MEF3 colonies exhibiting rough surfaces (Figure 2D).

lixiaodong

回复 10# 上海过客 , V" t; D8 ^. V7 p" j
beta-actin mRNA丰度太高，可能不适于作半定量RT-PCR，作Western则易于检测（但有文章说GAPDH更合适，因actin的结果很难达到半定量效果）。PCR的检测敏感度很高了，不表达和表达量低很难界定，有可能有假阳性吧，Western如不是优化后其检测灵敏度较低。免疫组化的则可以提供单细胞水平的检测。另外还有一些GFP的reporter mice，也可用来鉴定MEF中是否含有Stem cell吧。总之各种检测方法都有其优势和局限性的，多种方法交叉验证才能得到可靠的结论。

上海过客

回复  上海过客
1 b, s! B' k! j* p8 G3 @beta-actin mRNA丰度太高，可能不适于作半定量RT-PCR，作Western则易于检测（但有文章说G ...  ~2 M. }3 r& }( i4 s8 ]* E
lixiaodong 发表于 2010-7-3 14:03

# l( x2 n. H. }5 A; _7 ], Y1 @
5 R/ U- m: g: I; |; W3 a' y
现在的实验还都是做群体的 细胞  效应，单分子水平很难 做 。  单个细胞表达 GFP 可能在  群体里 也体现不出来 。  我并没有 否定 他的论文，只是 感觉到的确是有些问题解释的不太清楚 。   
  ]2 E5 p7 V- L1 x! ?  x3 R. }1 C1 u5 p$ o' D& P' F! w! O
    PNAS 上现在 有一篇文献 说明 在 成纤维细胞中提纯了 多能干细胞 。如果是这类细胞  被重编程呢 ？      
% ]1 ]7 g. K! u* R! t7 l9 |& d0 y6 Y, p* ~0 q
    关于内标的问题 ，我也仔细看过 了 文献 ，β-actin ，GAPDH， 16SRNA 都可以做 内参 ，但是 怎么选 ？ β-actin  虽然在普通细胞中 不变，但是 干细胞中，尤其分化过程中变化很大，做过的同学 知道 。GAPDH 是糖代谢的 基因， 胚胎干细胞和普通细胞的代谢途径 不同 ，这个 大家 知道吧 ？  尤其是小鼠的 ES细胞的 代谢 途径，去年有最新的文献 。  但是选NAT1 是什么道理 ？   . H$ g  x! I% S, q7 G; Z

+ Q+ t' V3 x" l' ]* X7 `0 x. z      PCR 本来就是来做 鉴定的 ，如果有 假阳性。对于这么一个 突破性的进展论文，有些牵强 。  real-time PCR  为什么没有做呢？   曲线 就很容易 看到区别了吧 。              那 他不做 ，有机会，我来做real-time  PCR  吧  。

cicadacjk

yamanaka第一篇文章中的iPS有很多是重编程不完全的，直到用Nanog-GFP(2007 Nature)作为reporter后，所得到的iPS细胞才大多数完全重编程。
' @2 Z- j4 i" o( H6 s. R所以06的文章中，只有少数的几株细胞被用来做最后的验证，比如你这张图，yamanaka在原文中就指出所得到的细胞多数并不好，后来在TTF的iPS中也只有几株比较好，有一株形成了13.5天的嵌合体。你引用的western图，是拿这几株细胞做的。此外，甲基化结果也证明yamanaka那些克隆Oct4启动子未曾完全地脱甲基化。之所以会有这种不完全重编程的情况出现，和当时用的是Fbxo15-neo的细胞是有关系的，实验表明Fbxo15在重编程的前几天就开始表达，它自己本身也不是核心的多能性基因，因而筛选出半桶水是非常正常的。% _6 x) o; o! B6 F7 Y
而在现在的技术条件下，用Oct4-GFP或者Nanog-GFP作为reporter，得到的iPS细胞系90%以上都可以形成存活的嵌合体。分辨内源激活层面的重编程已经不是难题。
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半定量PCR的假阳性问题是很正常的，使用定量PCR可能会更好一些。此外，在南京模式动物中心就有OG2小鼠出售，如果想iPS好挑一些，建议还是用这种小鼠的MEFs做实验吧。如果你没有这种小鼠，可以同时感染GFP病毒（假设你用的是逆转录病毒），这样你专门挑GFP沉默的克隆，效果也很好。

cicadacjk

回复 15# 上海过客 " K9 |5 a; {$ a9 d  q8 a, R

  N4 F6 F6 x7 U* F& f; h当时yamanaka的研究经费是很少的，选择较为廉价的方法也很正常，况且半定量做图的好处就是一目了然，有时候即便我有定量结果，也会倾向于用半定量放在主figure中。
2 ?3 P/ x/ [, q9 g+ zGAPDH做内参没什么问题的，如果你实在信不过，再加个18s，你就相信了。

lixiaodong

回复 15# 上海过客
9 I9 N" T2 X6 R: m( n
" i/ F9 _5 p/ ]+ p: H- }许多技术细节确实值得推敲，精益求精。希望你把你的新发现公布。Real-time PCR确实比半定量严谨一些，但除非是拷贝数是0，否则还是不能给出有或无的答案。但群体水平的检测确实很难如实反映小概率事件，大海捞针嘛。弱的信号不能鉴别如下两种可能： 999个0和一个1 vs 1000个1/1000。

上海过客

yamanaka第一篇文章中的iPS有很多是重编程不完全的，直到用Nanog-GFP(2007 Nature)作为reporter后，所得到的 ...8 I9 o& _( K; H. U( i" u
cicadacjk 发表于 2010-7-3 14:27

# ?  ~3 s( g5 Q
0 a) k  D# x, a$ M+ [, j谢谢 你的回答 ，你的回答 引导我更深入的 学习这篇文章。  
7 Y# h0 B$ h6 @3 a" @8 l8 Z* o# G7 v( ~2 V
这篇文章 ，我看了 至少有5遍了，注满了注释，但是可能还是没有看懂 。如果你有时间的话 ，请详细再解读一下这篇文章 。
& L7 W4 C/ T, f4 T5 I. v
7 E; a( L: R( e# ^7 r          谢谢

上海过客

可能有许多地方 考虑的不周到 ，希望大家不要见笑。:handshake