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作者：李树岩 回学军 纪磊 艾永顺 张文琪 李雷阳作者单位：(吉林大学第二医院心内科，吉林 长春 130041)
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( Y% s% G8 p! F" x7 G# D" }
) V. F0 z" ]* F! E2 K 【摘要】 目的 探讨碱性成纤维生长因子（bFGF）重组腺病毒转染骨髓间质干细胞（MSCs）促进VEGF的表达。方法 采用酶联免疫吸附（ELISA）法对转染bFGF重组腺病毒的MSCs实验用小型猪急性心梗模型血清中VEGF含量进行测定。结果 细胞移植后即刻组Ⅰ与组ⅡVEGF含量无统计学意义（P＞0.05），移植后第1w两者比较就有显著差异(P＜0.01)，而且组ⅠVEGF含量达高峰，第2 w、第4 w组ⅠVEGF含量与组Ⅱ比较差异仍有统计学意义(P＜0.05)。结论 bFGF重组腺病毒转染骨髓间质干细胞促进VEGF的表达。 . [+ H( J% I' Q5 G# P4 O
【关键词】碱性成纤维生长因子；血管内皮生长因子；骨髓间质干细胞
# q9 W6 u! }* P# c 基金项目：吉林省科技厅科研基金资助（20037004）0 `& [* z( ~2 ]3 b% s
5 t p/ R0 J7 ~5 w$ A 近年来细胞移植和基因治疗缺血性疾病成为研究热点。研究表明，血管内皮生长因子(VEGF)基因转染骨髓间质干细胞(MSCs)移植能显著促进缺血心肌血管再生，改善心脏功能〔1〕。而用成纤维生长因子(bFGF)重组腺病毒转染骨髓间质干细胞促进VEGF表达少有报道。本研究采用ELISA法对转染bFGF重组腺病毒的MSCs实验用小型猪急性心梗模型血清中VEGF含量进行测定，探讨bFGF重组腺病毒转染骨髓间质干细胞对VEGF表达的影响。1 m4 J9 b9 q" i- T; [& x
$ X; @& v w: P; Y% w! {0 H# y4 ~ 1材料与方法 Z/ D- J! E$ b6 n) E" z
9 M+ z; k. C) G5 l 1.1材料健康中国小型猪，8～12月龄，体重25 kg左右,雌雄不限（吉林大学实验动物室提供），携带bFGFGFP基因的重组腺病毒（由吉林大学王苹博士惠赠），羊抗人bFGF抗体(北京中山生物公司)，FITC标记的兔抗人IgG(北京中山生物公司)，VEGFELISA试剂盒（北京晶美生物工程有限公司）。
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1.2方法
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: [& r) Z3 D0 o! Y. e 1.2.1猪骨髓间质干细胞的分离、纯化、培养及猪急性心梗模型的建立方法参照参考文献〔2〕。
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3 m) `/ U* p J8 S$ r V$ j 1.2.2bFGF重组腺病毒对骨髓干细胞的转染在转染之前把猪骨髓MSCs培养液吸出，用DMEM洗一遍，加入不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)的bFGF重组腺病毒(用DMEM稀释)，MOI分别为0，5，20，100，200 Pfu/细胞，以PBS为对照，37℃振摇2 h，之后吸出病毒液，每孔加2.5％新鲜培养基1 ml。此后每12 h在荧光显微镜下观察一次GFP的表达情况，感染48 h。免疫荧光染色。7 X/ X( J" S, F5 J1 Y3 G
2 |, m2 i( K- E v! A+ A 1.2.3细胞移植及分组心梗模型建立后即刻,用氯胺酮、速眠新将猪麻醉,无菌条件下分离股动脉,造影见左冠状动脉前降支（LAD）远端完全闭塞。6FJL3.5造影导管放于冠状动脉口部,沿导丝送入2.0 mm或2.5 mm OTW球囊放于LAD远端,将球囊充盈打开堵闭LAD,随机分为2 组。组Ⅰ（n=8）通过球囊内腔注入转染bFGF基因的MSCs细胞100 μl；组Ⅱ（n=6）注入不含血清的DMEM 100 μl作为对照组。分别于移植即刻、移植后1、2、4 w取猪静脉血5 ml，EDTA 抗凝,10 min内分离血浆,置-20 ℃冰箱保存。用ELISA法检测血浆VEGF水平，步骤如下：提前20 min从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条。除空白孔外，分别将标本或不同浓度标准样品（100 μl/孔）加入相应孔中后，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育90 min 。洗板4次。加入底物显色剂，37℃孵箱孵育15 min。加入终止液100 μl，混匀后即刻测量OD450即值（5 min之内）。绘制标准曲线，读取数据。: \" ^% u2 F9 [3 B! V
- u: _- J3 n3 R/ u4 K3 ]" s% } 1.2.4统计学方法应用SPSS12.0 软件包进行统计学处理。计量资料用x±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。, @. F2 y' ^' ?* @
, l; V5 v/ K7 D/ W, t8 d3 E 2结果8 I! V: H: Q4 d# X2 \
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2.1bFGF重组腺病毒对骨髓干细胞转染效率鉴定bFGF重组腺病毒对骨髓干细胞转染后经免疫荧光染色，在荧光显微镜下呈现绿色荧光者为阳性细胞，未感染的细胞则无着色现象（见图1）。随着MOI的增加，染色阳性率亦增加，当MOI为100时心肌细胞荧光着色阳性率达95％（见图2），说明本方法构建重组腺病毒体外转染率高，目的基因能有效地得以表达。( {2 _1 v9 d! t. ^
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图1转染bFGF重组腺病毒的MSCs表达绿色荧光蛋白（200）（略）
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+ o0 S4 \$ Y; v4 O: { 图2bFGF重组腺病毒对骨髓干细胞的转染率（略）, W& }* Y6 J! e& s7 U6 N1 ], F) B
, X* W- g+ |; o" W( I+ i 2.2细胞移植后各组VEGF水平的变化细胞移植后即刻组Ⅰ与组ⅡVEGF含量无统计学意义（P＞0.05），移植后第1周两者比较就有显著差异(P＜0.01)，而且组ⅠVEGF含量达高峰，第2周、第4周组ⅠVEGF含量与组Ⅱ比较差异仍有统计学意义(P＜0.05)。
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表1细胞移植后各组VEGF水平的变化（略）
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/ F. h* O1 P; I" [8 c3 [ 与组Ⅰ比较：1）P＞0.05，2)P＜0.01，3)P＜0.05/ _; m4 ?# i) [: r
2 ?3 R6 H& ?7 M9 I# Z 3讨论
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* n: E! H; K+ q0 a8 A$ S+ O 1974 年Gospodarowicz 等首次从牛神经组织纯化到碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，能刺激成纤维细胞生长。bFGF 是具有多种生物学活性的细胞生长调节因子,对血管内皮细胞具有强烈促增殖、分裂效应,抑制内膜增生、促进血管侧枝循环建立和改善内皮细胞依赖性血管舒张的作用〔3〕。bFGF可趋化血管内膜的各类细胞,并诱导这些细胞表达组织重建所需的血浆酶原激活剂、胶原酶和蛋白水解酶等;这些酶类通过促使血管基底膜降解和刺激内膜各类细胞增殖与迁移,诱导血管内皮细胞长入胶原基质中形成管腔并促进新生血管生长〔4〕。bFGF可以促进干细胞增殖并向血管内皮细胞分化,诱导内皮细胞产生纤维酶原激活物和基质金属蛋白酶,从而降解基质,加速新生血管的管腔结构的形成和三维立体构像形成〔5〕。研究表明〔6〕,组织缺血后局部内源性bFGF 蛋白表达增加,促进血管再生以适应缺血的变化。$ j0 i2 D( r# C/ t! b/ X Q. L
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" U0 E6 r D( O7 ^; t+ F# \5 ] VEGF也称血管通透因子，是1989 年初被证实存在的一种与PDGF有结构同源性的糖蛋白二聚体,分子量为34～45 kD〔7〕。VEGF 有促进内皮增生、增强血管通透性、改变细胞外基质、加速新血管形成的作用〔8〕。VEGF 可促进体外三维血管生成,使融合的血管内皮细胞侵入胶原基质，形成毛细管样结构〔9〕。Li 等〔10〕发现鼠急性心肌梗死VEGF及其受体flk1和flt1的表达迅速增高,并在特定的时间内持续,其空间分布与新生毛细血管的分布一致。Gerber等〔11〕发现VEGF 能够诱导培养的人脐静脉内皮细胞表达抗凋亡的Bcl2蛋白,抑制细胞的凋亡,提示抑制血管内皮细胞的凋亡可能也是VEGF 促血管生成的一种机制。6 G1 H I7 ~/ q" `" Z
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8 o7 Y) w; f: Q' I. M bFGF 的血管生成作用部分是通过调节VEGF 的表达及生成实现的,bFGF通过与VEGF基因的启动子SP1 区(cfos区) 结合并使之激活,导致VEGF的表达增加,从而促进血管再生。研究发现,bFGF能显著提高局部VEGF 的表达水平,显示外源性bFGF可能诱导局部生长因子(如VEGF等) 的表达,增强细胞增殖活动〔12〕。bFGF还可通过诱导细胞内VEGFR2的表达增强VEGF的作用bFGF有四种形式，以AUG为起始密码的相对分子质量为18 000和以CUG为起始密码的相对分子质量分别为22 000、22 500 和24 000 〔13〕。 通常人们把CUG起始密码的三种形式统称为HMW (high molecular weight) 。而在这个促进VEGF表达的过程中相对分子质量为18 000和HMW bFGF都有作用。相对分子质量为18 000的bFGF 是通过旁分泌、自分泌或胞内分泌后与FGFR结合后进入细胞核，然后作用于VEGF 基因的上游序列,增强VEGF 的转录，从而使VEGF 表达增加〔14〕。
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9 |5 [5 x) U* f% K. f 本实验用bFGF重组腺病毒对猪MSCs转染，实验结果显示，转染组血清VEGF水平显著高于对照组，说明bFGF重组腺病毒转染MSCs显著促进VEGF的表达。研究表明，在正常的心肌细胞中有VEGF mRNA的持续表达,缺氧可以使VEGF的表达增加〔15〕。组织缺血后MSCs能自行迁移到缺血部位，并在缺血环境中横向分化为血管内皮细胞等，参与血管新生和促进组织功能恢复〔16〕。bFGF 等血管生长因子又可促进MSCs增殖并向血管内皮细胞分化〔17〕。但在急性心梗时仅凭自身的调节，缺血心肌局部分泌的VEGF水平不足以达到有效促进血管新生的目的，而联合基因治疗及细胞移植，通过多种途径可有效增加局部VEGF的浓度，达到治疗性血管生成的目的，进而最大限度挽救濒临坏死的心肌，改善心功能。虽然目前的研究只限于实验动物阶段，并未应用于临床。但此实验为临床应用外源性bFGF基因治疗缺血性心脏病提供了实验依据。" p3 L; L/ k' h0 j4 [% ^
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发表于 2009-3-3 11:47
发表于 2015-6-15 14:01
