阻断细胞内某一特定蛋白的表达

hxf_86

各位大侠，小弟请教一个问题哈～
- K: o$ ^% b0 f1 e  [7 x) k现在想寻求一方法，特异性的阻断细胞内一个蛋白（暂且叫这个蛋白叫B）的作用。) |" Y# q0 }* Q1 f) R& Q
以下是一些背景：
; _  E6 x, X+ N/ R, f# R# H7 A: X1.蛋白B是从一个大蛋白（暂且叫作蛋白A）中水解下来的! t) Z. P. v9 }) f9 `+ d' A) f# C
2.B从A中水解下来是自然现象，水解下来以后呢，A和B都有活性的, d: E4 Z% }" M  w# o
3.现在想特异性的阻断B的活性，但是要求是不影响A的活性，所以不能用RNAi
: Q1 h5 s3 \/ u/ V* H1 U6 R4.如果是用抗体的话，请问抗体能进入细胞核吗？
3 L6 F5 F/ S5 c$ t+ J7 P5 n6 ?5 Z谢谢各位大侠啦～

cavalieroar

构建b蛋白的突变体不知道可不可以？不过对于所知信息的要求比较高，要不突变掉与A结合的结构域，又要只使B的活性失效。而且天然蛋白还是存在，只能做到竞争干扰

hxf_86

回复 2# cavalieroar
0 L( p  P! C( z1 [2 a
( `, E$ K4 m* c1 r' M! J6 K) V. _
6 y; o) V/ ]1 O' D" q+ i    谢谢您的提醒哦。但是现在的情况是，如果突变掉了与A结合的结构域的话，那么这个蛋白A是不是刚翻译出来的时候就没有B了呢？如果是这样的话，就跟我的要求不符合了，因为这个是个离子通道，如果蛋白A刚翻译出来的时候就没有B的话，功能会受到影响（具体影响不详）。我现在是想，在A蛋白完整表达出来以后，B水解下来，在这种情况下抑制B的作用。3 ]) R3 }0 R; M. U8 ]; F
anyway，谢谢cavalieroar的回答哦

sunyucheng

可以将细胞穿膜肽+核定位序列NLS+B蛋白抗体融合表达后添加在细胞培养液中，阻断B蛋白的生物学功能，很好用的哦！！！真核表达，标签纯化，可以试试。

hxf_86

回复 4# sunyucheng # r4 I/ I$ @6 _( Q9 C6 Z
; D0 t) |- Z# s5 c3 j

: [* l3 E! n: @$ v- S2 s    哦，这对我来说是很很新颖的思路耶，首先很感谢你～  n# J/ J9 r4 j
我想问个问题，核定问序列在这个融合表达物种的作用是什么？
5 a5 f7 V3 T6 R: M* h, m; d还有，这样一来，整个表达物是不是分子量会变得很大？$ A+ J% r7 `1 V' i3 ]% m: K' S/ d9 G5 A
细胞穿膜肽是成品么？需要合成特定针对B蛋白的穿膜肽么？
+ k+ [+ V3 L. B, f& v, H灰常感谢！

weiyepan

回复 5# hxf_86 * A7 \# r* p" \
* F2 C/ w; A8 f/ Y- \' c6 v
我想提出两个问题：8 P; p. y0 H5 S5 @. e
1. 蛋白B是蛋白A活性的一部分是吧？如果称蛋白B的活性是活性B，楼主是想完全屏蔽活性B的作用呢？还是只是消除蛋白B对活性B作用的部分？如果是前者，我想可以直接突变掉基因，只留下A除B外的结构域。$ v1 L+ Q  ~' m0 |: J, z
2. 就算是使用抗体，B是A的一部分，能筛选到只抗B不抗A的抗体么？+ D9 M3 x5 u! T
另外，可以突变掉B和A连接的部分，使水解酶失效应该也是一个办法，不过具体要看楼主的意图是什么。

hxf_86

回复 6# weiyepan " I& j: J) M* ~# o# G' O( `

, y$ ~9 @) `0 T3 N: e
5 M' c! m8 e- i9 t    首先很感谢weiyepan给我提的宝贵意见～
( X, T' ^2 d% h1 {& s2 K问题1：是前者，就是只想消除蛋白B的活性。基因突变也想过，但是我不是很懂，我认为选择性的把B蛋白部分的基因突变掉的话，A表达出来的时候就是一个缺陷蛋白了，这样会影响蛋白A的功能吧？不过不知道是不是这样的. {4 J# Z% ~" Z) g) m
问题2：B的基因序列是已知的，应该可以根据这个序列去合成针对B的抗体的。你给我提了一个很好的问题，因为A上的B并不是全部都会水解下来，所以如果用抗体的话，肯定还是会有部分抗体结合到A上面去的，现在怎么去消除这个影响我暂时还没有想到。。。
0 L! v1 ?5 R+ I/ x最后，突变掉B和A链接的部分，是个好主意，我会好好考虑的，谢谢～

sunyucheng

回复 5# hxf_86
' ?: r# y$ J/ w8 ?: k$ g
7 C0 b$ g4 e* s! y4 J% x. b) Q% o: N  ~! Z* ~
    你不是需要抗体蛋白入核吗？核定位序列NLS可以使融合蛋白通过核孔入核。

sunyucheng

穿膜肽短的10个aa左右，NLS是7个aa的短肽，加上你的抗体蛋白aa序列，分子量不是问题。穿膜肽与目的蛋白的融合表达，没有针对性的，就看你选择什么穿膜肽序列，最简单的8个R(精氨酸)，或PTD（HIV tat蛋白转导域），很多，可以找一篇综述看看。

sunyucheng

http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_swjstx200602030.aspx