阻断细胞内某一特定蛋白的表达

hxf_86

各位大侠，小弟请教一个问题哈～
' {* f* W+ G, i6 X! f' K现在想寻求一方法，特异性的阻断细胞内一个蛋白（暂且叫这个蛋白叫B）的作用。
, T5 X/ n1 p; N4 U7 D以下是一些背景：/ I: ^3 |6 {$ F$ u- g: P
1.蛋白B是从一个大蛋白（暂且叫作蛋白A）中水解下来的3 N, i; v/ A+ D& u2 F: {9 o0 u" a3 ^- |
2.B从A中水解下来是自然现象，水解下来以后呢，A和B都有活性的
. c4 W" a) B+ m" @! z1 s9 {3.现在想特异性的阻断B的活性，但是要求是不影响A的活性，所以不能用RNAi
5 a( p% d4 d5 H4.如果是用抗体的话，请问抗体能进入细胞核吗？
, Q' |6 A4 C; R/ S* w谢谢各位大侠啦～

cavalieroar

构建b蛋白的突变体不知道可不可以？不过对于所知信息的要求比较高，要不突变掉与A结合的结构域，又要只使B的活性失效。而且天然蛋白还是存在，只能做到竞争干扰

hxf_86

回复 2# cavalieroar ; Y0 z; z- R) i/ e+ `. n
6 H( Y; S- B; j# h+ ~/ Y
  p0 e" s& @/ B( u1 u, j
    谢谢您的提醒哦。但是现在的情况是，如果突变掉了与A结合的结构域的话，那么这个蛋白A是不是刚翻译出来的时候就没有B了呢？如果是这样的话，就跟我的要求不符合了，因为这个是个离子通道，如果蛋白A刚翻译出来的时候就没有B的话，功能会受到影响（具体影响不详）。我现在是想，在A蛋白完整表达出来以后，B水解下来，在这种情况下抑制B的作用。5 l' |% i. C0 Z$ Z: e# k7 |( G, J
anyway，谢谢cavalieroar的回答哦

sunyucheng

可以将细胞穿膜肽+核定位序列NLS+B蛋白抗体融合表达后添加在细胞培养液中，阻断B蛋白的生物学功能，很好用的哦！！！真核表达，标签纯化，可以试试。

hxf_86

回复 4# sunyucheng
' U8 Y! z! q# O4 \
: {6 z* @+ D, B
6 _9 W7 o/ V8 B; {8 V    哦，这对我来说是很很新颖的思路耶，首先很感谢你～
9 r, z4 _6 E% x4 f我想问个问题，核定问序列在这个融合表达物种的作用是什么？' m' m. L" N, |
还有，这样一来，整个表达物是不是分子量会变得很大？: K3 [. V; s0 t6 r. d' U  k: m
细胞穿膜肽是成品么？需要合成特定针对B蛋白的穿膜肽么？
/ f7 O) C# u' p" X+ z  U灰常感谢！

weiyepan

回复 5# hxf_86 5 |, Y3 l; h+ O2 J# c! k( T
  E4 P/ P3 x0 E( U) K  `) l( x
我想提出两个问题：0 z4 F& U3 Z( o. F6 D* V
1. 蛋白B是蛋白A活性的一部分是吧？如果称蛋白B的活性是活性B，楼主是想完全屏蔽活性B的作用呢？还是只是消除蛋白B对活性B作用的部分？如果是前者，我想可以直接突变掉基因，只留下A除B外的结构域。
* V* }, K( i# W; b2. 就算是使用抗体，B是A的一部分，能筛选到只抗B不抗A的抗体么？& g) F! X. l, Z, U# G5 F
另外，可以突变掉B和A连接的部分，使水解酶失效应该也是一个办法，不过具体要看楼主的意图是什么。

hxf_86

回复 6# weiyepan
2 |/ b$ {2 \+ j; l7 I8 s2 v$ Z$ f+ @6 W$ m! D2 J& G. D
. U; b8 {# \8 K- _% U& z, x
    首先很感谢weiyepan给我提的宝贵意见～
3 U: }) x3 t% D; u问题1：是前者，就是只想消除蛋白B的活性。基因突变也想过，但是我不是很懂，我认为选择性的把B蛋白部分的基因突变掉的话，A表达出来的时候就是一个缺陷蛋白了，这样会影响蛋白A的功能吧？不过不知道是不是这样的
6 n9 O" J  o' c问题2：B的基因序列是已知的，应该可以根据这个序列去合成针对B的抗体的。你给我提了一个很好的问题，因为A上的B并不是全部都会水解下来，所以如果用抗体的话，肯定还是会有部分抗体结合到A上面去的，现在怎么去消除这个影响我暂时还没有想到。。。9 U  f2 ^( V7 C6 f8 E& V6 u; ]
最后，突变掉B和A链接的部分，是个好主意，我会好好考虑的，谢谢～

sunyucheng

回复 5# hxf_86 0 U. v. k3 p! f: h5 I

  L3 l% z# k4 v: D6 K; m. q
- m3 R! z6 }% Q) \    你不是需要抗体蛋白入核吗？核定位序列NLS可以使融合蛋白通过核孔入核。

sunyucheng

穿膜肽短的10个aa左右，NLS是7个aa的短肽，加上你的抗体蛋白aa序列，分子量不是问题。穿膜肽与目的蛋白的融合表达，没有针对性的，就看你选择什么穿膜肽序列，最简单的8个R(精氨酸)，或PTD（HIV tat蛋白转导域），很多，可以找一篇综述看看。

sunyucheng

http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_swjstx200602030.aspx