贴壁培养神经干细胞

深海寂寞鱼

回复 15# xfyang2007123
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to xfyang2007123：  K2 F! H1 `- X5 C4 |, a' h
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1.胰酶、胰酶＋EDTA、胶原酶、Accutase都可以用来消化。
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    虽然没有做过严格的对比，但是主观上感觉Accutase消化后细胞的活性好像要好一些。如果哪位战友，有相关经验，希望告诉我啊。
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+ x6 y6 r2 ~) R5 l    在sigma网站查了一下，没有看到Accutase的具体配方, 只是说ACCUTASE is a cell detachment solution of proteolytic and collagenolytic enzymes. Prepared in Dulbecco′s PBS (0.2 g/L KCl, 0.2 g/L KH2PO4, 8 g/L NaCl, and 1.15 g/L Na2HPO4) containing 0.5 mM EDTA•4Na and 3 mg/L Phenol Red。
1 X( z7 Y0 R( I4 k& L+ \/ Y0 N8 H    也就是说至少它里面是含有EDTA的。
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- G. f& q7 }9 Z1 b/ P   这是它的说明书：2 r$ N( X. n: e$ p* r% ]

/ e, i% N/ m' s9 H- F8 [4 w2. 在贴壁培养条件下，细胞是可以长期反复传代的。但是长时间的培养，必然会使细胞的特性有所改变。" h6 d7 {9 \6 T: |+ v3 [, v+ j
    如果能在10代以内进行自己的实验，结果应该能可靠一些。1 W, ]1 \/ c- O3 D4 l1 s: ~4 a
    我在培养过程中发现 随着传代，至少细胞的形态学在发生变化。

深海寂寞鱼

回复 16# jennyshy ' f- \: ?3 r9 M3 c1 b
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to jennyshy：& m7 S1 a; K! P3 {+ R
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    1. 用Poly-lysine包被的培养皿好像是不可以的，还有用gelatin包被的皿也是不行。原因是Laminine提供了类似于体内的微环境，比如类似于SDF或者integrin 6a。具体是在哪篇文献里看到的，暂时找不到了。找到了我会及时上传上来的。& |7 B0 o6 P. O( Q* _  r0 d

* G, i3 f' x* V$ ?" l; T* {    注：上面的回答是我根据印象回答的，或许会有错误。如果有误，我会及时更正。  J8 k( A' M9 M: R" o
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    2.我用的方法和文献里是一样的。
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    3.换液是没有特别注意的地方，和其它贴壁细胞的培养方法一样。当然我发现如果用PBS洗的比较狠的话（比如想去除一些细胞碎片），还是会把一部分细胞洗掉。' z  G) a$ ^" r! O5 S

0 w0 k3 u+ T% C+ a. g  V8 H    4.这种贴壁的方法可以使细胞长期传代，而且增殖的速度要比悬浮培养快。
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    希望你的实验能顺利开展。如果有什么心得或者发现，希望及时给我们讲讲啊。

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回复 17# jennyshy
/ q4 k: C, [9 v$ S2 o6 j4 `- K& Q/ Y$ G2 ^0 j7 p  S1 B
5 @$ @+ ?, R$ O: p
    关于protocol的问题，我觉得你可以自己从文献里整理。4 M. D  f% b; g9 ]. c4 [) q

0 U  e! A( a" p    这对于你自己来说也是个思考的过程，有助于更好的理解操作过程还有文献的细节。: B# s+ O& T0 H) i
( j/ }$ C" V- ]! p
    我这里有一个相对比较详细的protocol，个人觉得十分的好。不过它是用这个方法来培养肿瘤干细胞的。你可以参考一下。只要把里面的组织材料换一下就可以。希望能对你有所帮助。
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    附件：

jennyshy

回复 21# 深海寂寞鱼
! p3 j2 x# j6 \1 }* I) W0 r" y
0 c8 v0 g, _) U: x, L2 J
: S5 ^7 P. i3 {" p  U: V/ [    比较胰酶和accutase的好像是这篇文献，也是在网站上偶然看到的

深海寂寞鱼

呵呵。。。。。看来大家中秋节都休息了。
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1 Q: J3 E( j$ [3 A- ^# }* L我继续和大家分享一些贴壁培养的东东。希望大家一起讨论。
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" h' e6 X5 p0 s3 B这几天我尝试在贴壁培养条件下进行细胞转染。分别使用了invitrogen公司的Lipofectamine 2000和Roche公司的FuGENE HD两种转染试剂。转染条件均是按照各自的说明书操作。转染用了pEGFP-N1质粒。转染后48小时上流式分析。结果是Lipofectamine 2000能有大约10%的转染效率，但是细胞毒性很明显，能看到明显的细胞凋亡/死亡。FuGENE HD大约有4%的转染效率，但是细胞毒性不明显。因为这次没有足够多的细胞数，所以只做了两个试剂的比较。接下来可能会再试试Clontech的Xfect，maybe还得再摸索一下电穿孔的条件。一切还都在准备之中。等有了结果我会拿上来和大家分享。* X* {+ i, }7 @4 P9 K: N
9 }3 K3 g1 [5 V0 \! y
需要说明的几点问题：3 [1 n* I2 r) q8 K

2 ]3 I# y+ S- L3 E0 M1. 大家可能会觉得奇怪为什么我非要用质粒转染而不是考虑用病毒载体。原因是因为我设计的质粒中带有的元件，限制了我绝对不能够使用慢病毒和逆转录病毒。而腺相关病毒没有足够大的容量，也用不成。腺病毒是唯一可能用的，但是也有很多限制，所以一直没有想好是否换到腺病毒中做。  如果大家有什么好的建议，希望大家能告诉我。谢谢了。% `+ P3 {  u# h, l1 h
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2.  我还曾经尝试在悬浮状态下，对细胞进行转染，结果都是以失败告终。只是在很多次的失败中在荧光显微镜下看见到过一个转染进去的绿色荧光细胞。但是经过转染的细胞几乎都不能再形成球了。
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     以上是我个人的一些愚钝的摸索，或许有些问题在某个文献中已经解决了。但是限于读的文献不多，我还不知道。如果大家有人读到过类似的文献，或者在实验中有这方面的经验，还希望能帮帮我啊。谢谢啦！, ~. x. H/ w0 @; F" d
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     也感谢 干细胞之家 能为大家提供一个这么好的交流平台。

xfyang2007123

回复 21# 深海寂寞鱼
9 t; L! I$ w% \2 J1 x6 T( g& Z: y谢谢楼主了，希望以后多交流。

jennyshy

回复 6# 深海寂寞鱼 ' w- Q9 I6 r: Q" A- j
/ k6 @/ |" H5 h' k+ p

+ o: J3 ?  b: e# B    贴壁的神经干如何诱导分化？我的细胞是贴壁的，但是总是诱导不出来神经细胞……好多死细胞，细胞原来的形态也变了，细长型的
" @1 |% C) \+ }4 \! W+ \   期待给出好的意见

深海寂寞鱼

你具体打算诱导出哪种细胞？5 ^7 {" X& [0 T+ x6 R. }
7 F* E6 v, `8 B( B  m( |
神经元？  星形胶质细胞？  少突胶质细胞？9 h4 t, x% S8 d9 X, }2 \3 ]
3 V  W* g) Y1 i' `) y  z
还是说只要分化就可以？ 最好能把三种细胞类型就检测到？
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7 r8 H+ d. f- A& l你目前用的什么诱导方法？

leedh1223

恩，非常感谢

zhangmingqi111

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谢谢您分享的文章，学习一下