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1.MEF的获取：（步骤4－12已经进行实践）7 Y5 e# F3 k& v# K9 t# ?; @* b
（1）激素处理小鼠，同期发情和超数排卵
5 v9 T n! @1 R! l0 E （2）2：1合笼过夜(雌：雄)5 G, V4 t/ P, J8 V2 b
（3）取出有阴道栓（即乳白色或淡黄色冻胶状物，确定其已经怀孕）的开始记时间为0.5天 ( C+ R8 M& t6 l- P6 \2 [9 M: m
（4）取出妊娠12.5-14.5天的小鼠为实验材料: Y h ~0 l" t# T6 ]" y
（5）颈椎脱臼法处死孕小鼠，放于盛有75%酒精的烧杯中消毒，拿到超净工作台上解剖，先剖开腹部皮肤，暴露子宫，然后换另外一套手术器械，用眼科镊提起近子宫颈端,分离子宫系膜,剪断子宫角，取出子宫，置于装有PBS的培养皿中。
% X' S- r7 U) s3 v8 d （6）取出胎鼠，在PBS中洗涤数次。去除头、尾、内脏和四肢，仅留躯干部。在PBS中充分漂洗，弃除红细胞。(用两个镊子配合即可除去羊水膜、胎盘、头尾、内脏、四肢)（若是想培养神经干细胞，则用剪刀剪取前脑进行培养即可）（可以一起处理多个胚胎）
3 g$ A {; P% n+ x （7）在新的培养皿中加入少量PBS，放入躯干部分，用眼科剪刀剪成1mm3以下的组织块碎片（可以剪的更碎一点，下步的消化时间就可以缩短）。
9 v2 B* C' D# B/ D; h （8）加入2~4ml 0.25%胰蛋白酶，培养箱中消化10—15min，消化结束后加入等体积（多加点也行，只要不是少加，保证彻底的终止消化反应）的MEF Medium终止消化反应，轻轻吹打，使细胞分散。（做原代消化的时间稍长，胰酶用量也大，若是做传代，则只需加入500微升，最多1ml的胰酶，消化1~3min。）（躯干组织不易消化，做原代和传代时，故都用0.25%胰蛋白酶；而脑组织较易消化（脑肿瘤组织），原代和传代都用0.05%胰蛋白酶。）（消化可能不完全，也可室温静置5－10min，弃组织块，这样下面过滤就相对容易。）（如果消化得到的细胞太少，可以离心弃上清，PBS洗涤，重新加胰酶消化）（胰蛋白酶，Trypsin ,最适条件pH8.0，37度，溶液中钙镁离子和血清会降低其活力，故消化用的胰蛋白酶中加入了EDTA。消化结束时加入含血清的培养基即可终止反应）
0 {6 v3 } N, s （ 9）将收集的细胞悬液离心，1500rpm， 4min，弃上清，加入红细胞裂解液（3~5倍体积的细胞体积），轻轻吹打1min，离心除上清，若仍有红细胞残留，则须继续进行红细胞裂解步骤。8 L _/ A: d9 Z
（10）离心，弃上清，重悬细胞，过滤（200目筛网）并收集滤液，离心除去上清。
7 C% k( g0 j. p6 k- ]( `7 F# s6 t! U2 @6 u （11）用MEF Medium洗涤沉淀，离心除上清，重悬细胞，铺板即可。置于37度5%CO2饱和湿度培养箱中培养。（一只老鼠会有多个胚胎，得到的单细胞，可铺到三个培养皿中或者更多的培养皿中进行培养）
3 m. H& i7 i2 o! } N) [. V! {（12）第二天换液，随后每2天换液一次。培养2～4d后，MEF接近汇合，即可按1:3比例传代培养。
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* m+ C! [6 \% F# @, f" `4 h要点: 无菌是操作关键, 动物皮毛不能直接或间接接触到子宫, 分离子宫时必须换用另一套无菌的眼科剪和眼科镊。培养同一株胚胎干细胞最好延用相同品系小鼠来源的成纤维细胞。
' Q2 J' |/ V# \2 X4 S8 o8 Q; c要点: 仔细观察原代细胞有无被杂菌污染的迹象, 并且检测支原体, 确定无污染后传代扩增。" J D- D& u7 I2 }( ]; d
2.MEF传代（本步骤已经进行实践）9 `, t/ T7 p3 ~, Y
（1）消化：吸去培养皿中的MEF Medium，用PBS洗涤1次(加5ml)后，加入1ml 0.25%Trypsin/EDTA 37度消化1min（时间可以浮动，视消化效果定，在显微镜下观察, 当少量细胞漂浮, 贴壁的细胞层出现裂隙时，即可终止反应）。9 q/ o* S# R& ^2 }5 o9 c
（注：加PBS洗涤，是为了除去血清，否则胰酶发挥不了作用）
7 g0 u/ a; I0 h1 {- H/ _3 n% J# v" f（2）终止消化：加入5ml MEF Media终止消化（此时总体积为6ml），用吸管冲洗培养面并反复吹吸，使细胞离散成为单细胞悬液。(离心步骤省略：将细胞悬液移入离心管，1500rpm×4min。弃去上清液，用MEF Media重悬MEF成单细胞悬液。)+ b8 n: d7 d3 Y+ j4 w
（3）分装接种：吸取2ml细胞悬液到新的培养皿中（其中已经加了8ml培养基），再取2ml单细胞悬液加到另外一个新的培养皿中（其中已经加了8ml培养基），此时原来的培养皿中还剩余2ml，吸取8ml培养基加入其中，轻摇，37度5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。（1传3，其中2个是新的培养皿，1个是旧的（原先的），多省啊！ 100mm的培养皿，通常加10ml培养基）
) c/ I' v1 B7 ]4 @$ f. n' L' p. N（4）隔一天，视生长状况传代。
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+ E5 V* q2 e1 g. A/ `. ?注意: 每次传代尽量把成纤维细胞消化、吹打成单细胞悬液.. }) L8 L8 e9 N7 E
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( ]' D; t' f8 {! B }3.冻存MEF（本步骤已经进行实践）
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. a$ V# T- M4 |2 ?" x x. ]/ V# r在P2传P3代时，取三分之一的dishes继续进行MEF传代操作，另外三分之二进行冻存处理（本实验中P2有27个dishes，其中8个继续做传代，成24个dishes；另外19个做冻存处理，每个dish冻存一管）。; o# I: U; S" X
（1）取出19 dishes，吸弃media，加PBS洗一次（5ml）。- y! k% N$ ^4 D+ m+ d
（2）加1ml trypsin下消化1分钟，加2ml media 终止消化，轻轻吹打下细胞并分散均匀，收集细胞悬液到15ml离心管中（本次三个dishes收集到一个15ml离心管中），再加1mlPBS冲洗dish，并转移到离心管中。! U: Y2 S( n! ~8 u: \; y6 M
（3）封口膜封口，放在离心机里，1500rpm，4度，4min，离心。与此同时，配制冻存液。取出DMSO（二甲基亚砜，作冻存剂。本实验室的DMSO是常温下保存在抽屉里的。瓶子是深色的。），喷撒酒精消毒，放在实验台上。取两支15ml的离心管，每管加9mlmedia，然后每管再加1ml DMSO，混匀。
~( v0 T8 ?+ y7 k: f# ?（4）取出离心机里的离心管，喷撒酒精消毒，放在实验台上。取一管，倾倒去上清，加入3ml冻存液（因为要分装到3个冻存管中。冻存管总容量是2ml，最大刻度是1.8，本实验室通常加1ml冻存液进行保存），轻轻吹打几下，混匀细胞。取1ml，加入到冻存管中，放入冻存盒里（使用的是异丙醇冻存盒。异丙醇在冷冻细胞的过程中可以辅助实现缓慢降温，直接从室温放进-80可以达到近似于1度/分钟。异丙醇冻存盒在用之前要室温放置一段时间，让其达到室温后再用）。然后再对下一管进行操作。（应尽量避免细胞在常温下与DMSO的接触时间）
: d/ }) r! C) l& @3 i& [（5）把冻存盒放在－80度冰箱里过夜，第二天拿到液氮中冻存。（由于液氮罐已满，所以保存暂时保存在－80度冰箱里）0 q0 T4 u" K& v* b5 l, ]. o
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问题：一dishes太多，在消化操作时一定要快，否则第一个dish可能消化时间较长，影响细胞状态。% a# ~2 b: B8 ^, L* L! t
二加1ml PBS收取余下细胞时会，由于量太少易产生很多气泡，下次要增加量到2ml 。
# E, [$ U% ^- X2 T2 B6 W5 j y$ Y 三冻存液使用的是MEF media + 10%DMSO，这样FBS含量少，对细胞状态产生影响，下次要增加FBS的含量（适当增加FBS的量有利于提高复苏时细胞的成活率）。（MEF media由DMEM 11965 +10%FBS+1%P/S）( ~3 H0 a; j9 a7 \1 _( Y' a
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/ ~' H6 O, @0 W4. mitomycin C处理MEF，并冻存（本步骤已经通过实践）# N9 j% @; K6 ~4 N2 E% }
（1）当P3代MEF生长接近汇合时，吸去原培养基，用PBS洗2次（每次5ml），然后加入4ml 10μg/ml的mitomycin C处理MEF细胞，置于培养箱内2h。# _1 J. q$ H* p+ L- l
（2）弃去mitomycin C，用PBS洗涤2次（每次5ml）。
& F) G3 s- M6 q# d l/ F. x（3）加0.25％Trypsin 1ml消化1-3分钟，用2 ml MEF Media终止反应。轻轻吹打下细胞，并把悬液转移到15ml离心管中，用2ml PBS 洗涤，收集余下的细胞。（两个dishes的细胞转移至一个离心管中，总体积为5ml*2）
( q" ~' x, v+ T6 m8 n$ Z（4）1500rpm, 4度，4min，离心。与此同时配制冻存液（20ml MEF media + 2.5ml FBS + 2.5ml DMSO）。（此处相对3中冻存液，提高了FBS的含量，以期维持更好的细胞状态）( x3 h/ e& s7 X0 l G
（5）倾倒去上清，加2ml 冻存液重悬，分装到2个冻存管中，每管1 ml。标注信息。置于异丙醇冷冻盒中，放入－80度冰箱中过夜，第二天转移到液氮罐中保存。& k) x: d- I; a
& h1 q, ?8 A, _9 U5 |8 Y7 m E& |9 u注：上面用的mytomicin C 可以用MEF media (DMEM应该以可以吧)配制，也可以用无菌的PBS配制。（Mytomicin C是针剂瓶装的，10mg/支，可以采用无菌PBS溶解，配制成1mg/ml，装在15ml离心管中，锡纸包裹（需要避光），4度保存即可。用时再配制成工作浓度；若是用MEF media配制，可以直接配制成工作浓度，用时直接取用。最好买sigma的。）注意丝裂霉素C 的有效期和使用方法。若发现分装的丝裂霉素C 溶液析出结晶或溶液由浅蓝色转变成紫红色时, 说明丝裂霉素C已经失效, 不能再使用。
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/ t7 q; t% m' |" U) \5.复苏（本步骤已经通过实践）0 ], e6 b! A! s4 n" d' w+ e
（1）取出冻存管，在37度水浴中迅速融化（1－2min），当有少量冰块剩余时取出，用吸水纸拭干水，用75%酒精喷一下。（剩少量冰块与完全融化，效果差别不大。也可完全融化） I v0 r' Y9 h7 Z3 P
（2）用移液枪把冻存液转移至已加有5mlMEF Media的15ml离心管中1000转，4度，4min，离心。
: z- M( z0 f) I* ?, r* G* p（3）2ml MEF Media 重悬，转移至加有8ml MEF Media的100mm培养皿中，于37度5%CO2饱和湿度培养箱中培养。 |
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发表于 2010-11-25 13:46
发表于 2010-11-25 14:41
