小鼠骨髓间充质干细胞培养纯度问题

小熊不杀生

回复 feiyang 的帖子3 q" z0 F) D# @) I5 I$ B
* b4 ?. J8 \0 K" P7 y4 d& O
如果要求纯度在90%以上，还是需要做流式说明的，但是bmsc并无特异性抗体，我查到的文献提到CD34+、CD45+，你培养的是鼠来源的还好些，我的是兔来源的，贵不说抗体挺难找的，现在建议你把消化时间短的那些收集起来，最好不用机械力，你用的是玻璃瓶or塑料瓶？我用的是塑料瓶，贴壁性太牢，其实用玻璃瓶就可以了。减低血清浓度可以，我通常用10%FBS。

feiyang

什么叫“传代时差速贴壁来纯化细胞”，能具体指点我一下吗？

pebble

受益匪浅

feifei105

* Y6 G, x' |8 r$ {: j/ F3 @
  c5 C" \" H+ P8 U- Q9 T  A3 G
对于这个问题困扰了好久，我来说说我这段时间的感受：我起初做兔子的，很好养，诱导很成功，后来由于实验要求要用小鼠的，就用兔子的方法养小鼠的，但就是不行。小鼠BMSC绝对不同于兔，大鼠等，查文献它的成分更复杂，主要以巨噬细胞，内皮细胞为主，用通用的方法很难得到纯度高的MSC。我传代时很难消化，没消化下来的我觉得不是MSC，后来做诱导实验也证明了，没有分化能力。（我都是以诱导实验为准，流式也只是排除而且假阳性结果很多，还是觉得分化实验最有说服力）看很多文献的诱导图片也只是20%不到，纯度高的不是大多数都用流式分选，或是免疫磁珠。所以千万不能用养兔子，人和大鼠的方法套小鼠的，兔子的不需要这些纯度就很高的。% [9 G2 ?/ A2 ^; l7 m" w
以上只是个人意见，还是希望大家讨论。

elliotcc

我还在实验框架的建构中,选择一下密度梯度离心?贴壁法?离心分离法?哪个更好,为以后诱导打基础

djj01

有可能干细胞出现了不同方向的分化吧，我们的也是在第二三代时形态学会有变化。

fordhuhudadad

回复 feiyang 的帖子. Z  E. B: u. o, b
; }: b+ ]2 P: @* F4 n/ p$ Z  F
feiyang前辈，小弟也曾经做过 MSC的分离培养和扩增，都是到第三代就全变成 成纤维细胞了。目前这个问题都还没有解决，如果哪位老师有好方法一定记得告诉小弟哦！

pekingxiaoe

回复 feiyang 的帖子' p& Y0 ~. t8 V

! d7 b3 F% @2 n9 N$ ~# v/ s, G( s) X/ M如果你是从腓骨骨髓里冲出来的BMSCs的话，1、如果组织量较多的话可以先用Ficoll分离液离心一下，具体的操作要点可见360g离心，也可以消化完了之后再离心。2、一定要严格掌握贴壁时间差，利用MSCs比Fibroblast贴壁快，一般2-3小时后立即换液。倒掉没有贴壁的细胞。3、利用低密度培养的方法。MSCs增殖能力强，在很低密度的情况下也能很快增殖。（我试过100mmdish，种48个细胞也能长出克隆来。当然这个每个人养的MSCs有关）。4、就是可以用文献中这种，用0.5ml0.25%胰酶消化2分钟，然后倒掉消化下来的细胞。还是利用MSCs较fibroblast贴壁牢特点。具体见附件中的natrue protocol。希望这些能对你有用。

fish_zbw1985

回复 pekingxiaoe 的帖子
. b) L8 ?. g2 W2 ~1 D9 W$ u3 k+ ~* N$ d' b, s! }, r
我最近在分人脐带组织的MSC，用的是四型胶原酶法分离，是不是也可以用你介绍的这些方法分开MSC和成纤维细胞呢？

pekingxiaoe

回复 fish_zbw1985 的帖子5 h3 A* T9 I4 X# T

: r. @+ W2 G& W( ~( A2 Z可以啊，但是估计梯度离心估计不行了，其他的还可以用