电转染牛成纤维细胞的问题

wxl87

回复 runsong 的帖子$ i+ J+ z; A( `3 ]! t& ^7 \1 o

' L! s5 a6 o. ^$ @ 你的附件下载不了，解决一下

wxl87

质粒DNA最好要线性化，而且在电击以后，用自带的吸管吸出细胞，不要用枪头4 M4 ]% B( |* s8 d& L) g
而且看看你的荧光镜有没有问题

zpzp0312

质粒需要线性化
' s4 C- t0 I0 E! \/ _! v+ A& u: K: `细胞需要单细胞悬浮
: ^: p7 \* M/ Y5 s, B* S  d  Y* ~介质建议使用商品3 \# k6 P# u! P* ~8 v4 O" Q! B( G3 E' |8 ]
但DMEDM和PBS也可以使用，没很大区别5 p  Y" f: c6 h# H" R. n+ n
另外50%死亡也不是必须的，死亡率也不是评估电转正常的关键指标啊，没必要看中这点

xiangchou812

不知道你的质粒中的Red2有没有活性?建议先转染一下293细胞看看有没有活性.祝好运!

miRNA

稍等一下，我把所有的buffer都整理一下，发出来....

miRNA

Hank’s buffer：
& ]" z+ G  O$ n, D8 N4 W% l' f* ?0 M
$ r3 }9 n, G& d6 Y8 Z8 j7 d137 mM NaCl; $ M% q, a' |6 b4 B
5.4 mM KCl; 9 l3 w" o) T% b
0.95 mM CaCl2;
# o3 e& U( U( c, Q0.41 mM MgSO4; 1 y6 W' D6 Y/ Z$ i
0.49 mM MgCl2; 2 Y8 z7 b1 \* O! q% m
4.17 mM NaHCO3;
, _) ]: d0 {1 y0.34 mM Na2HPO4; - b5 h+ |6 u5 p* b; I0 i; R
0.44 mM KH2PO4;  
4 C  p" T( W. t( R: E1 {20 mM HEPES, pH 7.2 3 x8 H  Y* d6 ?) Z5 \0 Z
$ r% n/ m/ Q; R* N( {5 |- L
可以直接购买来自HyClone Hanks' Balanced Salt Solutions(HBSS)。
" i9 ~6 _9 G4 s9 Z来自文章---Efficient expression of foreign genes in CHO DHFR(-) cells by electroporation

miRNA

Berg’s buffer
) j# b9 r, H0 S, b! `/ s- N' y# l5 b# ]( s6 G  Q! Y% T8 m( ], V  G" _" x

8 l# j$ S5 j+ o2 @名称        需要量        分子量        配制100ml所需1 z5 l. P4 ^  o3 l6 s) j' W9 h) I- V
NaCl        137 mM        58.44        0.8g" G# Y/ L$ N" Z8 I: R/ a( y4 t
KCl        5 mM        74.55        0.037g$ ?4 T( @9 `0 J/ \0 m0 A4 [* `
Na2HPO4  (-12H2O)        0.7 mM        358.14        0.025g
3 O  O4 v$ v/ X9 a. OHEPES    (pH 7.05)        20 mM          238.30        0.4766g
# v0 @0 G; T+ W  a" e. U: X0 Fdextrose        6 mM        198.17        0.118902g0 o) d% c- m% O- r( b0 @0 W

/ _' g0 F# t7 Q* _( K同样来自文章---Efficient expression of foreign genes in CHO DHFR(-) cells by electroporation

miRNA

还有Cytomix buffer,文章里面有，就不列出来了...

miRNA

Optimization of square-wave electroporation for transfection of porcine fetal fibroblasts
2 \/ I: Q, j, ~这篇文章里面用的是混合配方:
, p, X0 t* w3 c0 i' r' g8 w) VCells were resuspended in transfection media (75% cytosalts [120 mM KCl, 0.15 mM CaCl2, 10 mM K2HPO4; pH 7.6, 5 mM MgCl2] (van den Hoff et al.1992) and 25% Opti-MEM): @2 m, ]3 X4 b' R' J/ X
+ W2 {3 C$ @7 q4 [9 I

miRNA

我自己试过1640，DMEM，Hanks' buffer，
* I; l7 O  y' W) B! k6 m! k说实话，别浪费时间摸条件了，从公司买现成的电转buffer吧...
! F, f: Q( ~2 F; |不过个人很看好最后一个混合配方，我自己没有试过，( v( D5 r+ M6 B5 B4 A
用各种盐成分配置成的Hanks' buffer和DMEM等相比，感觉有明显的不同，" ?" H0 l/ I/ H# ~: ~6 F. `; Y3 h
因为都是离子成分，应该是电阻很小，电流很大，所需要的条件和DMEM相比应该不一样，$ ^1 E" ]1 U. p$ j" V- u
所以混合两者成分，应该是好一些...否则只用DMEM会比较钝(？个人理解)...
) m- l" w2 u* R" X! W) e* i. I: l* ~; \2 m  B0 u
同时质粒的纯度要很高，如果你只测260/280或260/230是不可能看出来质粒的纯度的...
' y+ E+ b" x5 d6 o% p高纯度的质粒转染效率会明显(?也许只是稍微)高于低纯度的质粒...; v7 o) u. @( n- M6 d
! e4 M0 \: p1 O( ^% _* I& o
希望idealgas会很快做出来...
" k6 [$ ~) {; k+ d! s7 r6 ?谢谢您的回信！在此回复，以示感谢！
, d" @( u5 U  }! x* a