电转染牛成纤维细胞的问题

wxl87

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: G& D  o( T; i6 z& B7 y
" p4 g5 \& u' n6 U' i 你的附件下载不了，解决一下

wxl87

质粒DNA最好要线性化，而且在电击以后，用自带的吸管吸出细胞，不要用枪头
9 h1 k5 b3 y$ a# B/ Q3 w* u+ K而且看看你的荧光镜有没有问题

zpzp0312

质粒需要线性化
* k3 {+ c3 ^5 A4 }* p细胞需要单细胞悬浮
2 `$ d& K% q( x2 Q3 Y! G介质建议使用商品, O3 ?3 q7 r2 Q6 L
但DMEDM和PBS也可以使用，没很大区别" |5 s6 x* y: o, g: r' N
另外50%死亡也不是必须的，死亡率也不是评估电转正常的关键指标啊，没必要看中这点

xiangchou812

不知道你的质粒中的Red2有没有活性?建议先转染一下293细胞看看有没有活性.祝好运!

miRNA

稍等一下，我把所有的buffer都整理一下，发出来....

miRNA

Hank’s buffer：
6 I$ @8 z* D9 j3 j2 z1 Y; L$ \. ^/ j
137 mM NaCl; 9 E( o0 c' Y' e, F1 A
5.4 mM KCl;
1 v8 I. @! @: S# g! g# |0.95 mM CaCl2; 5 p- a# w7 E* u9 s/ o
0.41 mM MgSO4; ; O9 ~8 Y% @. x! }4 D9 K
0.49 mM MgCl2; ' B$ O1 L' g1 L  m1 V7 j, I
4.17 mM NaHCO3; ( N+ D  V. x% W1 @
0.34 mM Na2HPO4;
# R  Z  n- k5 d0.44 mM KH2PO4;  & S) y8 E% H7 Q" D
20 mM HEPES, pH 7.2
! c' k' e- ]2 m( n9 \) t9 O
; A1 C( L  a5 a' L可以直接购买来自HyClone Hanks' Balanced Salt Solutions(HBSS)。4 q" t" @* j; l2 {) [
来自文章---Efficient expression of foreign genes in CHO DHFR(-) cells by electroporation

miRNA

Berg’s buffer
$ F  m* G+ h7 s7 U0 m2 l5 F; A2 ^8 \1 ]9 ?+ b' F3 C* l

! N2 f2 \, Y( b" {( I名称        需要量        分子量        配制100ml所需0 B* r% R1 ~9 E7 z' p! H
NaCl        137 mM        58.44        0.8g+ W5 j# ]) p/ y  M: z
KCl        5 mM        74.55        0.037g
: d; u* G$ S0 E& I- ?. ~Na2HPO4  (-12H2O)        0.7 mM        358.14        0.025g8 C! z, ~* m3 z5 F
HEPES    (pH 7.05)        20 mM          238.30        0.4766g7 D7 z! B$ j! |- n+ @
dextrose        6 mM        198.17        0.118902g9 u( w" ]# }  [4 @) V3 _1 N

1 f* r4 o: Z7 Z& s同样来自文章---Efficient expression of foreign genes in CHO DHFR(-) cells by electroporation

miRNA

还有Cytomix buffer,文章里面有，就不列出来了...

miRNA

Optimization of square-wave electroporation for transfection of porcine fetal fibroblasts. y" A$ H( |- `  O* u  {2 M
这篇文章里面用的是混合配方:
  e5 |' ?8 Y+ y/ N) BCells were resuspended in transfection media (75% cytosalts [120 mM KCl, 0.15 mM CaCl2, 10 mM K2HPO4; pH 7.6, 5 mM MgCl2] (van den Hoff et al.1992) and 25% Opti-MEM), ]  K0 ?, b  b, }5 _

8 P! i4 l; U0 h/ B) R

miRNA

我自己试过1640，DMEM，Hanks' buffer，0 p* J- p! T0 Y: I, U8 Q
说实话，别浪费时间摸条件了，从公司买现成的电转buffer吧...7 I5 i$ k5 y. V4 y7 O2 m; H
不过个人很看好最后一个混合配方，我自己没有试过，
4 X6 E) h1 p8 ~# b) E用各种盐成分配置成的Hanks' buffer和DMEM等相比，感觉有明显的不同，
' Y8 w; a6 b8 h因为都是离子成分，应该是电阻很小，电流很大，所需要的条件和DMEM相比应该不一样，
2 w, i9 B5 x+ t所以混合两者成分，应该是好一些...否则只用DMEM会比较钝(？个人理解)...9 q  k2 [4 t% n9 W4 X/ d' n- Y) L
7 w/ O) v$ p, g7 F
同时质粒的纯度要很高，如果你只测260/280或260/230是不可能看出来质粒的纯度的...+ `3 r6 _' z+ R& z" n
高纯度的质粒转染效率会明显(?也许只是稍微)高于低纯度的质粒...3 t& K. b: ^2 D: X. Y" G

* q- ~1 b0 a! y6 O. T; y" S; b希望idealgas会很快做出来...
  d' _" L# o+ T: ^7 \谢谢您的回信！在此回复，以示感谢！
, W0 U& A  g0 f# X- b