电转染牛成纤维细胞的问题

wxl87

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+ K2 a! V/ d: z% `8 _- h3 j/ H9 v9 L* `5 T) z- W
你的附件下载不了，解决一下

wxl87

质粒DNA最好要线性化，而且在电击以后，用自带的吸管吸出细胞，不要用枪头1 p* u$ ^6 t5 N/ z" [
而且看看你的荧光镜有没有问题

zpzp0312

质粒需要线性化; G. O, z9 \6 f
细胞需要单细胞悬浮, g1 [; F1 j9 o) r, X: W. o
介质建议使用商品
0 |+ q8 [1 Y6 i2 y; o" m但DMEDM和PBS也可以使用，没很大区别
7 k3 M- K5 e( H7 Q: _另外50%死亡也不是必须的，死亡率也不是评估电转正常的关键指标啊，没必要看中这点

xiangchou812

不知道你的质粒中的Red2有没有活性?建议先转染一下293细胞看看有没有活性.祝好运!

miRNA

稍等一下，我把所有的buffer都整理一下，发出来....

miRNA

Hank’s buffer：
8 h: S$ U1 s5 ~3 U$ a2 E: J. @* o/ L9 m
137 mM NaCl;
. ]* a6 G2 A: X# k7 j5 A4 Q5.4 mM KCl;
# n# {+ Y- z+ w- y- G* i$ R% q: `0.95 mM CaCl2;
: }: U5 @3 I  g' _1 ^- r0.41 mM MgSO4;
+ ^% |) ?, P! x& u2 d. ?1 d' C2 b0.49 mM MgCl2; 3 z. [2 {& L6 a$ d& m# i9 l
4.17 mM NaHCO3;
4 a$ c3 q6 J" u# l. v0.34 mM Na2HPO4;
/ E, R" [: X; d/ W. L0.44 mM KH2PO4;  9 \# H' \8 H) ?) n$ K  R% W" X
20 mM HEPES, pH 7.2
: a" T7 ?( A( L4 V) `* k+ t7 o. }, q; C/ a# K
可以直接购买来自HyClone Hanks' Balanced Salt Solutions(HBSS)。
* P+ L, G1 ^/ ^来自文章---Efficient expression of foreign genes in CHO DHFR(-) cells by electroporation

miRNA

Berg’s buffer' t) Z/ `. Y" t

9 B  ]* R! @' H
; F- z5 Z- }6 j+ {; Q$ \名称        需要量        分子量        配制100ml所需" F& V3 V5 c% m) d0 C4 Q8 k
NaCl        137 mM        58.44        0.8g
$ N$ J# y/ i9 H, n$ Q( Y1 FKCl        5 mM        74.55        0.037g
. U9 @% l) e' ?) wNa2HPO4  (-12H2O)        0.7 mM        358.14        0.025g
. z" j4 F# I- PHEPES    (pH 7.05)        20 mM          238.30        0.4766g
7 E$ G4 \9 O' ]8 ^; @  t% j- Gdextrose        6 mM        198.17        0.118902g
) B/ T7 z# B! V
: a1 U. q2 e# d/ Q4 J% `5 P4 N$ f同样来自文章---Efficient expression of foreign genes in CHO DHFR(-) cells by electroporation

miRNA

还有Cytomix buffer,文章里面有，就不列出来了...

miRNA

Optimization of square-wave electroporation for transfection of porcine fetal fibroblasts
/ F( Y1 y# A$ |, O这篇文章里面用的是混合配方:
0 p' t+ v# B( g" \* R, D$ w2 BCells were resuspended in transfection media (75% cytosalts [120 mM KCl, 0.15 mM CaCl2, 10 mM K2HPO4; pH 7.6, 5 mM MgCl2] (van den Hoff et al.1992) and 25% Opti-MEM)5 j7 h  @9 \9 m3 ?+ P

% D& s, P  L- _& |6 ^- X) n4 g1 P

miRNA

我自己试过1640，DMEM，Hanks' buffer，
( E' C, W3 G( x' _说实话，别浪费时间摸条件了，从公司买现成的电转buffer吧.../ m9 p4 }0 M& g8 j3 S. \$ u% H' P
不过个人很看好最后一个混合配方，我自己没有试过，' J# h: X* ^2 L5 E7 b2 V
用各种盐成分配置成的Hanks' buffer和DMEM等相比，感觉有明显的不同，
7 L5 H0 u, I+ _因为都是离子成分，应该是电阻很小，电流很大，所需要的条件和DMEM相比应该不一样，
) L' a: j9 l: A- @) w# |- v. \6 @所以混合两者成分，应该是好一些...否则只用DMEM会比较钝(？个人理解).../ p+ I# S5 v' u" ?! u) F6 N# r" K$ o

2 a* i/ \! t. u1 C. j9 R同时质粒的纯度要很高，如果你只测260/280或260/230是不可能看出来质粒的纯度的...
0 D! Q9 w. g8 L3 v高纯度的质粒转染效率会明显(?也许只是稍微)高于低纯度的质粒...- @3 s, h3 X' `' d9 g0 i& ^, I
% r4 W3 ]" M6 B6 B! ^( C
希望idealgas会很快做出来...
6 x8 B) L0 f. A+ c谢谢您的回信！在此回复，以示感谢！4 o$ l2 [0 y' R$ v* z0 Q