电转染牛成纤维细胞的问题

wxl87

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! |7 N1 \9 {6 V7 g  e$ a; z
你的附件下载不了，解决一下

wxl87

质粒DNA最好要线性化，而且在电击以后，用自带的吸管吸出细胞，不要用枪头1 w. @) r$ E% L( @, C( N
而且看看你的荧光镜有没有问题

zpzp0312

质粒需要线性化4 v- k% P" |' {2 ]! W
细胞需要单细胞悬浮4 H& [/ M  {0 R5 t: p
介质建议使用商品
( Y: p* t5 Z2 P8 b但DMEDM和PBS也可以使用，没很大区别
) ]8 H* m$ r* [另外50%死亡也不是必须的，死亡率也不是评估电转正常的关键指标啊，没必要看中这点

xiangchou812

不知道你的质粒中的Red2有没有活性?建议先转染一下293细胞看看有没有活性.祝好运!

miRNA

稍等一下，我把所有的buffer都整理一下，发出来....

miRNA

Hank’s buffer：/ M4 [  L% j( E. O

; {* a' D* V, P137 mM NaCl; 8 \& p: {- a" ?' V7 s- i
5.4 mM KCl;
; A' N# Y. T# C0.95 mM CaCl2; % C' s- A1 }- A  i
0.41 mM MgSO4;
! z* |! ~8 Z: O; }' K( ^0.49 mM MgCl2; , Y! H4 P5 \" @0 w( w# f
4.17 mM NaHCO3; 4 N! ?8 D  t- t* F9 F0 x
0.34 mM Na2HPO4;
7 [: l2 ], x9 @9 ~, I7 R. l0.44 mM KH2PO4;  # A7 t6 z! n# G
20 mM HEPES, pH 7.2 , s; j+ o) ]& v7 Q% c4 @  G! w
, y  y7 Z' h1 G" R$ A" A8 ]
可以直接购买来自HyClone Hanks' Balanced Salt Solutions(HBSS)。
0 G- E. X) l5 q1 f  g来自文章---Efficient expression of foreign genes in CHO DHFR(-) cells by electroporation

miRNA

Berg’s buffer) d* O8 `0 A9 N0 n* m1 Y% [8 [0 E! l

5 f3 _" u% J3 q# C$ Y2 `4 p
. O5 t5 {- H: ?+ k- n% u名称        需要量        分子量        配制100ml所需
, M: L5 I3 B& ^' M8 V1 jNaCl        137 mM        58.44        0.8g
; H9 W5 b) o  aKCl        5 mM        74.55        0.037g
( d8 ]; X/ `0 i' j8 U; bNa2HPO4  (-12H2O)        0.7 mM        358.14        0.025g) V$ ^3 x! z$ A6 n
HEPES    (pH 7.05)        20 mM          238.30        0.4766g
& a3 u# a( p0 Z5 Z+ vdextrose        6 mM        198.17        0.118902g
9 z& ^: n& r% i) M0 _) k6 r3 K& U1 F2 [/ Q% c% P7 o+ K3 l$ u
同样来自文章---Efficient expression of foreign genes in CHO DHFR(-) cells by electroporation

miRNA

还有Cytomix buffer,文章里面有，就不列出来了...

miRNA

Optimization of square-wave electroporation for transfection of porcine fetal fibroblasts# C8 h. Y& z5 |
这篇文章里面用的是混合配方:
2 t' ~# e, H5 H/ }  ^! F9 HCells were resuspended in transfection media (75% cytosalts [120 mM KCl, 0.15 mM CaCl2, 10 mM K2HPO4; pH 7.6, 5 mM MgCl2] (van den Hoff et al.1992) and 25% Opti-MEM)
+ s4 z7 x; g" H# F5 B3 X" b; X- m" S- t- X3 X# h/ ~

miRNA

我自己试过1640，DMEM，Hanks' buffer，$ _" ?( w7 v; Q7 u# c
说实话，别浪费时间摸条件了，从公司买现成的电转buffer吧...
& t$ }0 J; \. B" |# Y8 d6 `" e- D不过个人很看好最后一个混合配方，我自己没有试过，
( {$ B' O8 |* N$ V/ ]; I用各种盐成分配置成的Hanks' buffer和DMEM等相比，感觉有明显的不同，. x2 Z2 D5 ^0 F) K0 }
因为都是离子成分，应该是电阻很小，电流很大，所需要的条件和DMEM相比应该不一样，
, x$ i. f& k9 c, f1 ^5 t9 l所以混合两者成分，应该是好一些...否则只用DMEM会比较钝(？个人理解)...: m5 m/ q1 v0 Y! T+ L
( ~& s" c6 E0 p
同时质粒的纯度要很高，如果你只测260/280或260/230是不可能看出来质粒的纯度的...$ Z1 ^+ q8 G; O4 u0 L2 T
高纯度的质粒转染效率会明显(?也许只是稍微)高于低纯度的质粒.../ u# x( Q* [- V" l4 h6 A* B

+ Y3 ?9 S" A  z" h3 \5 f4 `* ]9 H希望idealgas会很快做出来...
2 p8 D. Z- k. {+ ~谢谢您的回信！在此回复，以示感谢！
/ x: w: U4 N# m- A: C8 H. G) j) h