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本帖最后由 细胞海洋 于 2011-6-7 23:35 编辑
6 D/ @) z- ?. i, L! g( \0 P5 B9 D4 W4 Y/ X" t& u9 ^+ j
刚看到一个人发的贴（满病毒载体构建原理），感觉不是很齐全，慢病毒载体构建原理，你百度一下，百度会告诉你，在此补充一下其它方面比较实际一点的东西2 s2 M9 N; ^( L6 I3 c9 u/ _+ R6 \) R0 X
包括293T细胞培养，慢病毒载体构建，滴度测定等
5 e: P2 \/ C& x4 {+ c一、目的: `/ s0 `/ V/ y/ A+ q6 v3 C/ X% S
采用慢病毒转染293T细胞的方法对目的基因慢病毒载体进行包装并对慢病5 k) M8 y( p! Y, I2 ]( k" K, X
进行滴度测定。+ E" D% b: R1 \3 E! t0 j& X" j
二、材料
* L: d0 ^* q ]2 }细胞株:293T% T: m7 p& y# {9 Y8 `
菌株:大肠杆菌菌株DH5α {3 O7 ?1 l' a4 x0 k) B
病毒载体:（a)pGC-LV重组载体；（b)pHelper 1.0；（c)pHelper 2.0
4 |. L( C+ R0 ~+ i( ]DNA溶液的制备：以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取慢病毒包装系统中三种* V! S; l) D6 `9 r3 ?2 s5 d; o% g
质粒DNA，质粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证% k. F# L/ a0 a
所提质粒DNA的A260/A280在1.8～2.0之间。1 R/ V- ?. m3 w; J# X7 J
1.主要试剂1 f7 |; K- `4 b7 N
台盼兰 美国Sigma公司6 a4 O4 u5 ^2 |% h( p
胎牛血清 美国Hyclone公司6 l' A, ?2 y% \7 T2 T3 z+ }2 W
DMSO 上海生物试剂厂- Q2 h* w& O! S4 a
DMEM 美国Hyclone公司
7 g7 V* j9 S% f$ [4 _ 胰蛋白酶酶 美国Gibco公司& d+ z7 R" j% T. ^! g5 @
Lipofectamine 2000 Invitrogen
4 @% u6 t$ B- i1 } H5 f! ?2.主要仪器
$ Y8 `/ B6 P5 t/ Q 荧光显微镜 奥林帕斯( L4 x8 m r3 i/ b
CO2培养箱 上海力康7 P. g/ \$ y* l3 O( D
生物安全柜 北京东联3 ]6 S; E- {5 y1 H
Plus-20离心超滤装置MILLIPORE
4 P7 r! ?8 O# P- Y三、方法
- `, `; {3 f8 K: {（一）293T细胞的培养
. n4 ^/ E' f8 O0 G3 w: X5 b1.293T细胞计数
* h2 v* }9 q4 b* o- b# X1 ]) [# f 用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000个/ml,在0.1ml的细胞悬液. K7 N3 [3 g4 @7 j
中加入0.1 ml的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数
; A% u" W @# [) C细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。
. A0 h- Q1 ] ?; G- r6 a: |* U N( q& b' N6 Z6 P
2.293T细胞冻存
2 ]4 l1 c5 A, P( }4 N8 ~ e（1)取培养2～3d生长旺盛的细胞，用细胞培养液将细胞配成2×106-2×107/ml! F8 N% h- `; ^& x5 ?$ P" Z6 {% Y* \
（2)在1 ml细胞冻存管中加入0.5 ml细胞悬液，0.4 mlFBS和0.1 mlDMSO，混
t( ?7 K# z& t: n匀后密封。置4℃10min，-20℃30min，然后直接放入-70℃保存。
5 `$ ?/ [4 i, u. e6 z/ ?5 _; \) S* g7 o2 h( r9 b8 }2 L2 {) u
3.293T细胞复苏
) C! ^6 C7 F( D \( e; }（1)从液氮罐中取出细胞冻存管，应带有防护眼睛和手套。/ }# e+ x2 e9 h, H
（2)迅速放入盛有37℃水的水浴中，并不时摇动，尽快解冻。8 R) C+ B2 j% s+ {! Y7 P
（3)用70%酒精擦拭消毒后，移至净化台上，吸出细胞悬液至培养瓶中，补加3ml8 ^$ @- v5 }0 l
含10%FBS的DMEM培养基，置温箱培养。4 I& O( W0 l' H2 f8 q
（4)次日更换一次培养液后再继续培养。
% I/ E8 z k1 F4 G! F1 h* J7 i
4 O) T& e- ~8 R! ~$ B4.293T细胞传代1 s) i+ ^# O' [7 g G
（1)弃去旧培养液，加入5 ml灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然
+ F. r& ?: ?- b6 }6 {# [后弃去PBS溶液。
6 O% ^# K3 c$ ?0 y（2)加入2 ml胰酶消化液，消化1-2 min直到细胞完全消化下来。
0 j+ s% t" N: t* ^8 B* k（3)加入含10%FBS和100 U/ml双抗的DMEM培养基5 ml，用刻度吸管吹打数次，9 B* D v1 b, E9 V$ _* b% C
将瓶壁上的细胞冲洗下来。
. C4 G8 @3 j" [% A- i（4)混匀细胞后分至两个新的培养瓶中，继续培养。
& Y! r$ T! v% o4 T$ R# r
# h, r- C1 O: e0 E（二）慢病毒包装$ [+ E5 f4 ~6 R- [& M7 V5 e
1.293T细胞转染' ?- Y9 @( u3 {) r
（1)转染前24 h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10%FBS的培养基% N) E0 B; V5 [
调整细胞密度为1.2 x 107细胞/20 ml，重新接种于15 cm细胞培养皿37℃、5％CO2培养箱内培养。24 h待细胞密度达70%～80%时即可用于转染。) V+ x$ |' O1 t/ `0 e
" G5 b$ H6 C. `: }. F9 A（1)转染前2 h将细胞培养基更换为无血清培养基。% d, Z% n5 Q' a( Y# Q
（2)向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(pGC-LV载体20μg，pHelper 1.0载体15μg，pHelper 2.0载体10μg)，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为2.5 ml，在室温下温育5min。- K5 M4 h- Y* Y* s0 f
（3)将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取100ul Lipofectamine 2000试剂" E- q9 Y) E4 {
在另一管中与2ml Opti-MEM混合，在室温下温育5min。: H5 m( [+ G( T; D
（4)把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混
0 }' {. G9 @" C3 J/ L1 l' W# G" w匀，不要振荡。必须在5min之内混合。4 R3 @% s3 K, Y/ ^
（5)混合后，在室温下温育20min，以便形成DNA与Lipofectamine 2000稀释液
0 A9 o; F% b+ c9 R. j7 ~的转染复合物。
. N/ y. K' f7 S7 m' J# l# B. E$ w（6)将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，" t# i1 [) Z3 {7 c1 C O. }, G h
于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养。% C3 W2 w6 z! i: S
（7)培养8 h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20 ml的PBS液，) x2 {" b/ J& ?
轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。0 r' r6 B# W2 I3 |7 a4 q3 N
（8)每瓶细胞中加入含10%FBS的细胞培养基25 ml，于37℃、5%CO2培养箱内$ e* m, @' F* L
继续培养48h。
4 a" l1 S2 ?; x N8 Z- D% m( ]& f8 g8 C, r" t
2.病毒的收获及浓缩+ z7 ^% G7 g( Q6 `6 z- _7 S8 T, T
（1)收集转染后48h（转染即可为0h计起）的293T细胞上清液。" k; W6 U$ t& g5 C3 B" ?( Y0 x1 `
（2)于4℃，4000g离心10 min，除去细胞碎片。9 {% F, N! u9 C6 K/ ^6 E" _
（3)以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中。
* k' F) e7 ?3 I1 M- s（4)把病毒粗提液样品加入到过滤杯中（最多19 ml），盖上盖子。将过滤杯插
3 m6 z; m$ p5 C: k到滤过液收集管中。
% n) G! ^7 v& f) J( `1 T% m4 N' {. L（5)组合好后，做好平衡，放在转头上。
/ ^, w) P# U6 {( H0 ]8 }! c! `（6)在4000g离心，至需要的病毒浓缩体积。通常需要的时间为10-15min。: E9 ?! {% e/ N3 q( W
（7)离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开。( C! ?8 h& I/ V+ X j9 ^
（8)将过滤杯倒扣在样品收集杯上。
7 h- i* J) \) r% o（9)离心力不超过1000g,时间为2min。过高转速会导致样品损失。把离心杯从
. d& b, w1 u8 t9 n8 i. i样品收集杯上移开。样品收集杯中的即为病毒浓缩液。
3 @- ~# U' Q1 U- y7 o' f% S3 x（10)将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-70℃长期保存。取其中一支4 l5 e6 ?; E, S; L
进行病毒生物学滴度测定。
5 q0 M- s) J7 F# ?' a Q7 N- @. v- i3 T4 O% x
3.慢病毒滴度测定
6 s: p4 \* Z8 F' P& r/ ^2 a! l4 M. U孔稀释法测定滴度
1 N* }. f0 C2 w- w. j4 l7 w（1)测定前一天，为测定滴度所需的293T细胞铺板，96孔板，每个孔加4×104
6 A, \6 Y: Z1 @' D! ?. D X7 D个细胞，体积为100μl。
0 R( x) X) t) C7 e（2)根据病毒的预期滴度，准备7~10个无菌的Ep管。在每个管中加入90μl8 ^6 q" V' j, f0 ]# Z& u; F
无血清培养基。* [# }7 S/ X# u6 Y
（3)取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中，混匀后，取10μl加入
8 {! j- n* D' T4 }到第二个管中。继续相同的操作直到最后一管。& }. g3 _! b5 J" i& p2 Y
（4)选取所需的细胞孔，吸去90μl培养基，丢弃。加入90μl稀释好的病毒* T) t* a. p. t, E3 A$ s6 c" E3 U1 @
溶液。放入培养箱培养。
A7 {" Z2 L7 p; x（5)24 h后，加入完全培养基100μl。小心操作，不要吹起细胞。& }* {6 U- V/ n3 F$ Q
（6)4d后，观察荧光表达情况。荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。+ A; V4 |$ l `
说明：3 g. g; O( S- w) t, `" _
第一个Ep管中加入10ul病毒原液，记为1E+1μl；, g, A. `5 G$ l0 W( F7 e' A* H8 T
第二个Ep管中进行了第一次十倍稀释，所得病毒原液为第一个Ep中的1/10，记为1E+0μl；
% e( _& o; T$ e1 b5 S9 n第三个Ep管中进行了第二次十倍稀释，所得病毒原液为第二个Ep中的1/10，记为1E-1μl；
% b3 F, f V; D! z1 l1 j- ]依次类推…
2 Y$ Y ^2 H$ E- ?/ m. z% p第七个Ep管中进行了第六次十倍稀释，所得病毒原液为第六个Ep中的1/10，记为1E-5μl；
% c1 _0 t1 ~, b第八个Ep管中进行了第七次十倍稀释，所得病毒原液为第七个Ep中的1/10，记为1E-6μl；
! F$ M1 i* A4 W0 C( t. Z+ x# s6 l8 R( n) F3 C7 v; Y
四、结果0 i* U" ?) g; E& X# V
% D5 K0 P4 l6 Z% q/ L: \$ l3 C慢病毒滴度计算:
# p4 P" B4 v9 Z! P5 a& {0 g根据荧光图片中GFP表达情况，在加入1E-6μl病毒原液的孔中观察到2个; }- [/ b% H. R+ V. Q
带有荧光的细胞，说明该孔中至少有2个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度
+ F+ O: `* {+ b c6 [* o/ a4 |等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，即2/（1E-6）=2E+6，单位为TU/μl,
, M' v1 b, o2 }0 ?, |( N也就等于2E+9TU/ml。按照此方法对四种目的基因慢病毒载体进行滴度测定，结
' N# @4 b! ?3 n果如下：5 i& V/ h# a; g' _! P J& N O
Oct4–慢病毒载体滴度：1E+9TU/ml
; h1 w( E0 T9 ASox2–慢病毒载体滴度：1E+9TU/ml* `# p* {$ T% { C
c-Myc–慢病毒载体滴度：1E+9TU/ml- `# h4 w7 B1 Q% Y$ o
Klf4–慢病毒载体滴度:2E+9TU/ml |
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发表于 2011-6-7 21:19
