求救，转染的问题

always_wp

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4 K$ B# D7 m/ m: b" a" d* o4 N1 G9 o" X2500RPM这个转速会不会太高，还有想请问一下，如果要是转染ES，消化为小的细胞团块，怎么计数呢，是一个什么样子的细胞量呢，还请说的再详细些啊，谢谢啦

sdjjfangfang

病毒的滴度一定要高哦，转毒之前可以将细胞转到feeder free上进行培养。可以考虑根据ES的状态调整何时更换培养基，如果掌握的好的话，可以提高病毒的转染效率。

wwy551

回复 always_wp 的帖子0 F' A; o7 s. U7 o$ Y# a

+ f9 {) U8 Z2 r: u& u2500RPM离心转染贴壁培养的细胞，没问题的，我们实验室一直这么做的。
) u6 w0 C. s$ q9 U9 K. u转染ES的时候，不用计数啊，保证病毒肯定是过量的就可以了，而且也没必要转染特别多ES，因为染过毒的细胞状态比较差，你得传个两代的样子，然后加药筛或者流式分选。

always_wp

回复 sdjjfangfang 的帖子" F1 I5 ^/ \- A' t

9 v9 \# \1 o! K" ~4 w. }+ e"转毒之前可以将细胞转到feeder free上进行培养”可是我的ES和ips都是在feeder上养的啊，没有feeder的没有养过啊，这一点是不是必须的呢？是为什么啊？2 ~! Q4 F; q7 M' C9 _" |# }
“可以考虑根据ES的状态调整何时更换培养基”是指感染后的状态么？怎么掌握啊~！9 H5 j- z' Z) w- M
还请说的详细些啊，我真的不是太明白。谢谢啦

always_wp

回复 wwy551 的帖子- {* ?9 s2 ]+ V- W7 |- F
% w! B& w! b3 w* b7 N
“转染ES的时候，不用计数啊”如果不计数的话，是怎么判断病毒感染ES时，是怎么的量呢？我很茫然……
# m8 u  i: r. V# a“保证病毒肯定是过量的就可以了”是怎么确定过量？1 j+ j2 F: G7 z- ?+ V
"而且也没必要转染特别多ES，"是怎么才是感染的多或者少啊，怎么判断，怎么计数啊，是数克隆么？8 `7 _( H1 {3 n/ M3 _' K
哎，我太菜了，请多指教啦
2 [& W; t* T' U! K

christophe

同问，高手能否给个详细的protocol呢？

wwy551

回复 always_wp 的帖子( t/ B9 g, Z$ P7 Q
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你的目的就是要建过表达某种基因的ES细胞系嘛，只要保证最后有克隆能被病毒转染上，经过抗性或荧光筛选出来就可以了。我们用293T包装慢病毒，浓缩后基本能达到10的八次方每微升，消化一皿10CM DISH培养的ES（正常密度就好，这个也没有很严格要求）做转染，你想你用几百微升的毒液去感染那么点ES，怎么都不止每颗细胞就对应一个病毒颗粒吧。这就算过量了啊。做这个真的没有必要向你想的那样计较那么多~~

always_wp

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! n6 R$ ?+ g: n# K% X- p) J能不能有你们发过的文章或者相似的文章给我借鉴一下啊 ，或者是有没有类似protocol的文字啊……+ V. p3 O! z% k) w" R
哎，主要是我没有做过，就觉得哪一步都很不清楚，很不确定的感觉，  e: E+ {. [: q! j0 ~* U% @: X. |
谢谢啦

wwy551

回复 always_wp 的帖子( z# ~! ^* k; z4 V! W$ E
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这个还真没有唉，我们实验室做HESC向不同成体干细胞的分化。实验室之前出的Paper好像都没有没详细的关于在ES过表达外源基因的，顶多说一下用慢病毒转染建系。我因为快离开现在的这个实验室了，之前一直被催着把自己这几年在这边做的涉及到的各种实验技术整理成Protocol，无奈一直事情很多，我又挺懒，就没好好整理。但是，我觉得我在这个帖子里面提到的基本上已经是一个完整的Protocol了，而且很多注意事项也都包括了啊~~很多东西都是这样，不是什么会不会的问题，只是你有没有做过，要不你先尝试着做一下，有什么问题再讨论~~祝好！

sdjjfangfang

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7 ?7 y8 @0 x4 O在feeder free上培养是为了去除MEF。最好这样做，把MEF去干净些。把病毒转染入MEF里比转到ES里更容易些。貌似你也不需要转染有目的载体的MEF吧。还有一个问题是，如果载体本身带有GFP的话，最后应该进行分选。这样就会带一部分MEF在分选的细胞里。虽然可以通过细胞的不同大小把ES和MEF分开，但是还是会夹杂一部分MEF在里面。
5 Q$ _, }& V" X  D3 N' s0 D“考虑根据ES的状态调整何时更换培养基”是根据转染后的状态，如果细胞状态好一些，可以考虑补加培养基，而不是把含有病毒的培养基完全更换掉。如果细胞状态不好，则就赶快更换新的培养基吧。. N4 d' Q$ D% {- b3 k. i) C! l