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【材料及准备】
4 d: g9 U3 X& U) H/ u# x: a5 Q1.一般的盖玻片，或专用爬片；4 ]' y1 R5 O" {0 R# l" O$ [! R
2.根据需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；
$ J8 V6 k4 V3 z# ~3.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍，放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。
; @+ p7 U" ]. l# b4.高压后取出放入烤箱中烤干，备用。烤干后可放入超净台中。
. ]1 m$ j* _; Q& \5.关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。
6 A5 P, g5 H- q, p# C( v+ @. \, s6.常用的固定液
+ z7 A5 V( H0 R( q0 k6.1丙酮 可用于一般的免疫组化染色。0 @( S$ c9 I L
将纯的丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮（放心，丙酮在此温度不会为固体的）细胞爬片取出后，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很强的挥发性，注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严，防止其挥发）固定10分钟。取出后，室温吹干，然后放入-20℃保存。! K& M1 r# K% A. }; W5 `) f
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6.2 多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。 ! y: x3 d' k9 c( K) N
主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等
5 }! f7 f, m1 L# _; A B0 |. {室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存: g4 Z, ^; U8 k9 H' k) z
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6.3 95％乙醇，可用于免疫组化。
8 R0 T) w E1 J ~8 c+ w优点：穿透性强、抗原性保存较好。
( A/ Y: B' g, y0 v缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度
5 V$ N2 b7 V5 J+ j' n" U$ g" ?; @室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存, k& |" K0 B0 Q+ z
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6.4 甲醛(福尔马林)应用最广
# R" k, R$ P0 ~( N* t优点：形态结构保存好，且穿透性强，
6 X' C, h7 ?& }% K) a4 `缺点： 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色； 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。
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【细胞爬片步骤】
% |* C. r. a. l, ~: i1 j" G1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。
0 I" e: [6 ~* I! Z, u& p2.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作。0 K7 |0 @5 T! f+ k( k: S
3.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可
9 o! y: S% M, g9 q# z4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。
: B" l5 h+ o' y5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。末取出的可接着继续培养。* Y0 W; H$ {+ N* ~
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【细胞爬片的固定】
3 x5 [7 n; y* ^0 C细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。当然，根据研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。+ @7 U* c# T) E0 G) l; ?% v, u8 u
另外在保存细胞爬片的时候，一般用培养皿或板，先在皿底放一层面巾纸，然后再放爬片，这样方便做实验时取片。然后盖上盖子，并在盖子上做标记，为避免混淆，可用透明胶带将盖子和皿连在一起。一般-20℃保存2-3个月的片子做免疫组化是没有问题的。) u. @2 \5 W7 ?! e% I2 {
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发表于 2011-6-23 22:26
