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【材料及准备】8 h+ I, i- t" k+ y
1.一般的盖玻片，或专用爬片；0 B5 o5 g0 H' X
2.根据需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；! Z6 h `0 _% w8 w5 |
3.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍，放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。
6 G6 t) |# r0 _6 _! i* N: ]5 {4.高压后取出放入烤箱中烤干，备用。烤干后可放入超净台中。" I) t# O; S; b3 U4 U0 n
5.关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。6 V! ?/ p% K8 ^: a( v) L! p: T
6.常用的固定液
% x! `% V l$ c% j6 t }3 D6.1丙酮 可用于一般的免疫组化染色。/ a8 h& X% M' c( x- P% R
将纯的丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮（放心，丙酮在此温度不会为固体的）细胞爬片取出后，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很强的挥发性，注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严，防止其挥发）固定10分钟。取出后，室温吹干，然后放入-20℃保存。
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6.2 多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。 + V" z& R- d* D0 |, J
主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等3 X4 _. v8 e* ?# @
室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存
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$ ^; O M. p, K% n; O! [. o6.3 95％乙醇，可用于免疫组化。
7 I( K1 W1 Z: z6 _8 r优点：穿透性强、抗原性保存较好。
( V# J9 y+ `+ B" {/ l缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度
0 W9 e& u6 l9 ~( h: j9 [2 Q室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存 {" s; w+ |5 C9 Z+ K
% @: r% _6 t) N2 ?6.4 甲醛(福尔马林)应用最广
, Y% M- l3 _% M" s优点：形态结构保存好，且穿透性强，
* o2 t6 L$ K* w/ }0 ?缺点： 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色； 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。
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【细胞爬片步骤】" k) o# m8 L' |# z' |& z
1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。3 U& f! Z2 B& ~$ m3 t
2.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作。/ f: m7 I \' e# `: ^; J, C
3.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可) q8 r. S2 C; e5 j* y
4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。
- j: R4 t1 @2 s& D$ e8 P+ v+ m" } s5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。末取出的可接着继续培养。
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5 c% I4 E! }+ P+ u6 R9 ^【细胞爬片的固定】
* t. ]6 m1 _1 S# M0 [" Q3 ^细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。当然，根据研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。
9 B2 O: z2 {: a5 x0 T' M( L- C另外在保存细胞爬片的时候，一般用培养皿或板，先在皿底放一层面巾纸，然后再放爬片，这样方便做实验时取片。然后盖上盖子，并在盖子上做标记，为避免混淆，可用透明胶带将盖子和皿连在一起。一般-20℃保存2-3个月的片子做免疫组化是没有问题的。
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发表于 2011-6-23 22:26
