我要崩溃了，求求高手老师帮帮忙吧

tk1504008

         从3月份开学以来，我养的海马神经细胞就没好过。养到第二天貌似就全部死亡了，显微镜下几乎找不到细胞。
2 z2 W: u5 K0 y  i+ S    我养的是新生大鼠（24h）的海马神经元，取海马后，剪碎，0.25%胰酶消化20min，含血清培养基终止消化，1000rpm离心10min,弃上清，用无血清培养基+0.2%B27培养，每个皿2ml，24h后全量换液，每隔3天半量换液。
( L2 S, k  p# {! h( I    很奇怪的是：在显微镜下看，培养皿底部环境很不干净，细胞周围有很多杂质，形状想很多小黑点，有大有小，不知道这些杂质是什么，是组织碎片？死亡细胞的裂解碎片？还是其他的？而且第一天全量换液后，杂质依然存在，虽然比换液前少了一点，但是还是很多。滤网似乎也滤不掉这些杂质，因为它们比细胞要小很多。杂质多的话细胞死的就很快，而且长得很不好。
8 }* J; h- u/ C) e# ^1 B" m     求求各位老师高手大牛能不能帮帮我这是为什么？我实在想不出原因了
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yxc

   1.胰酶消化很关键，最好放进37度细胞孵育厢，终止消化、离心后，一般是将絮状细胞团提出，在另外一个装有无血清培养基的离心管中涮洗一下，再进入第二个无血清培养基的离心管静置5分钟，然后吹散、过筛。
* [; D  q4 N$ i, }/ T    2.B27对于神经元的存活很重要，一般浓度为2%，即100ml培养液中要有2mlB27添加剂，我们都是买invitrogen的B27，而且要看准类型。4 F# i) O! R0 F7 s2 b
   3.避免污染，甚至添加双抗防患于未然。/ j2 u, e& a  n$ \& x2 S( @* v3 a
   再找人分析一下，学习别人怎么做的，自己跟着试试，很快就会成功的。

dingyx2009

我对你的培养方法产生很多疑问：# X: x% t8 A0 {( \0 I$ h
1.   不要老看细胞，24-48h是细胞的敏感时期，更不要全量换液。
% \  V8 ?  \; V4 V9 J- _+ Y6 L2.   要想细胞活性更好，换用E17,18天的胚鼠。
/ i; _# p% Z: n6 Y3.   无血清培养基+0.2%B27，我觉得B27的浓度太低，调整1%-2%。还有B27有三种，有养干细胞的，胶质细胞的和神经元的，别弄错了。
) G) K+ @3 N( d: A8 ~! i4.   黑色的杂质多为细胞崩解碎片，多次换液就会更干净了。再者终止消化离心的转数和时间调整一下，我们1000r，5或6分钟就可以完全离心下来。另外，我还怀疑是你消化后，吹打次数太多太猛也会造成杂质过多，并且细胞活性不好。* x! Y) U1 z0 o$ ?  F+ ~& a
祝顺利！
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aminhair

我虽然没有做过这个实验，但是我觉的你看的东西还是有点少。
% @3 J" n0 w# d8 k- t( h+ e9 b$ @6 x对听一听上面两个老师说的话。觉的主要问题还是你培养液的问题。
/ |) x  g) w3 K  h- i# C至于黑的小点，不用管，只要好好操作，按时换液，充分清洗掉死细胞，其实不影响你细胞的。

aminhair

我虽然没有做过这个实验，但是我觉的你看的东西还是有点少。9 w0 N2 K- z2 R8 q- v
对听一听上面两个老师说的话。觉的主要问题还是你培养液的问题。5 |. c4 j  U0 @
至于黑的小点，不用管，只要好好操作，按时换液，充分清洗掉死细胞，其实不影响你细胞的。

ljzmy82

我个人也认为是培养基有问题，要不重新换下培养基看看结果怎么样？

superlamp

胰酶消化的分寸掌握很重要，注意观察细胞悬液消化时的分层现象，可以加胰酶消化出现第二层后，大约10~15min，再加入DNA酶消化，出现第三层时，共约20min，终止消化。2 m3 L" m7 B$ C) T
另外，你的离心速度和时间选择也不好，很容易将细胞离死，从而看到你所说的大量碎片，建议800r/5min。
/ m8 s  `8 `. w$ S9 o0 M  }# w你的培养基成分也不合理，可以加入EGF/Bfgf/LG,帮助分选NSCs

nobelmao

楼上的，看好了人家养的是海马区神经元，用EGF/bFGF养神经干细胞干嘛？
" H: l* G# T% ~) l, }我分过好几次大鼠幼鼠神经元，我的经验是大鼠脑取材后应立即将其放入冰冷的无血清培养基中，并在取海马时应时刻注意应在冰上操作，这点很重要，神经元代谢很快，不降温会死的！还有除了消化以外应全程冰上或四度操作！6 |, `; R$ U8 ]9 P
消化时我用0.125%的胰酶消化15-20min，记住，之前一定要建成1mm3的小块，这样才能消化开( _9 C) I# v) n& O
消化后用血清终止消化后再用玻璃吸管吹打把吹打下来的上清移到冰上，其余组织块继续加培养基吹打& V8 G+ b/ e) `1 V) G- i! f$ t, C4 r
最后将总的细胞悬液800rpm离心，铺盘（看到你没提铺盘前有没有多聚赖氨酸coating，如没有一定加上，否侧细胞不会贴壁）
- F/ B. A$ |- K" h7 c7 i最后想说一句，神经细胞不能增值更新，所以不能像分NSC一样那么粗心，细节上一定注意，稍有不慎前功尽弃

nobelmao

对了还有一些注意的% {  v  t/ u( W5 V" Y
培养基铺盘培养基DMEM/F12+2%B27+10%FBS  4个小时后换维持培养基 就是前面的不加血清，当然用invitrogen的成品培养神经元的更好
8 K# w0 N( m- K0 N细胞铺盘密度一定要大，一个六孔板我铺300万，铺少了细胞之间不能很好的连接不能生存  J2 _, W: H- g) x: a- J; \
多聚赖氨酸铺板后一定用PBS洗几遍，过量的多聚赖氨酸对细胞有毒性

liuerfu

黑色的杂质多为细胞崩解碎片，多次换液就会更干净了。再者终止消化离心的转数和时间调整一下，我们1000r，5或6分钟就可以完全离心下来。另外，我还怀疑是你消化后，吹打次数太多太猛也会造成杂质过多，并且细胞活性不好。  I5 Y1 t* @. w4 R  e  y& x, [% `# P
祝顺利！
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我培养的细胞也有小黑点，一直找不到问题。谢谢你的解答4 V4 z" N9 d; I0 q