western检测磷酸化抗体

mayansen1314

最近在网上查看关于WB的一些常见错误，有一条说检测磷酸化抗体的时候不能用脱脂奶粉封闭，不知道各位有谁验证过这条，我前期做过一个磷酸化的抗体检测，一个月的wb都没做出一张漂亮图片，不知道这是否就是原因所在，请指教

jhu132llh

是滴) |9 u& L) T/ a6 y: g
很正确
. E4 a8 ?- G" D% s检测磷酸化抗体都用BSA
) y) D9 B5 {, a4 T; K: q5 W不能用脱脂奶粉的原理忘了，反正是有这样一条

pheebs

没有吧，我用脱脂奶粉封闭后检测cell signaling的一些磷酸化抗体，效果很好啊！

pheebs

google了一下，“我在abcam公司WB protocols上看到，之所以不用脱脂奶粉来封闭磷酸化蛋白，是因为脱脂奶粉里含有酪蛋白（casein），由于也是一种磷酸化蛋白，所以磷酸化一抗会跟酪蛋白非特异性结合引起高背景”。但是我从来没有遇到过这种情形。我裂解细胞的时候碗里头加了磷酸化酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，一直用脱脂奶粉做，条带都是很明显的。

mayansen1314

& W( m3 C% ?! F) K2 ^* k% O3 O. a, w1 j; W0 k( y
回复 pheebs 的帖子) [! X6 j+ b- C  S9 f( C

4 |6 M3 D8 U6 f- p! d  R我用脱脂奶粉封闭过，当时的背景就是很高，黑黑的一片，当时我以为是一抗二抗没洗干净，后来又做了几次都是一样，当时就没注意到他们说的这一条。
, g; E! g5 |/ T- X1 r

mayansen1314

回复 jhu132llh 的帖子
" o6 H, j3 H# v! b7 I, q; ^9 v9 }& [, t- s
http://www.stemcell8.cn/thread-43456-1-1.html

jhu132llh

good

james_0619

我做过，确实用牛奶封闭做不出好的效果，实验室有人用0.5%明胶来封闭,做出来的效果不错,我做的是磷酸化的ERK

sallyshaomy

用牛奶或者BSA封闭对实验结果影响不大，你的磷酸化蛋白分子量是多少？我觉得WB关键步骤在于转膜，不同分子量的蛋白其转膜时间差异较大。你试着摸索过转膜时间了吗？

runsong

回复 james_0619 的帖子
$ j5 Z9 {# {/ |3 y
% K) n" A2 m( A! ^) b磷酸化ERK的抗体你是在哪里买的，我最近也要做。