x-gal染色的假阳性问题

viv2005

$ F# @8 z2 B$ [$ S4 }最近想看看我的一个转基因老鼠有没有插入lacZ基因，于是收了刚出生的老鼠，做了x-gal的染色，因为不是专门做这个的，所以没有去准备那些菁化物。2%的x-gal是另外一个做突变的试剂盒提供的，我用PBS稀释到了1mg/ml。然后37度孵育过夜，发现有的地方出现了蓝色。
9 c* g* f. V; B因为没有control，所以我今天又收了1只应该可以算作wildtype的老鼠，做了同样的染色，不到12小时，也出现了蓝色。+ Q# b* P8 s2 U8 S- `7 K& B* H
我现在想请问的是，大家觉得我这个问题出在哪里？
1 |& J8 i! t9 u0 y我自己觉得，1，可能是配方的问题，因为所有的protocol都用了菁华物，我不清楚他们的作用是什么，有没有人能解释一下。
/ r8 ]6 R+ l4 n. W9 o* [2.这个X-gal有问题
5 [5 x1 z1 M6 U% {) c3.x-gal染色的假阳性率高么8 Q# y, O7 i# k+ S/ T& g4 U4 ^5 o
4.我的wildtype的老鼠genotype出了问题。
+ ~! j, _+ ^8 ~8 j% E4 V请大家不吝赐教，多谢

viv2005

nobody knows? Oh, my god! What can I do next8 C  H6 o# f; F6 O+ r% Y5 {

shen_coco

我只用过专门的染色试剂染的，是碧云天公司的，从没出现过假阳性，没用过你的方法。

seanboy

X-gal的假阳性绝大部分都是和pH值相关的。你可以查一下资料。我记得是偏酸的情况下，WT且没有senescence的细胞也能染上蓝色的。所以一定要调准pH值，且每次实验都要有足够的control。

viv2005

回复 seanboy 的帖子
# y3 [* C/ a- y9 H
; a3 _8 X0 v. L2 T& W非常感谢你啊，那到底PH值低到什么值就会假阳性呢，我用的7.4的PBS稀释的X-gal。文献上好像说不能超过8.0，有点疑惑了，难道要用8.0的tris缓冲液试试

sylar.wy

X-GAL假阳性很高吧- - 我做酵母双杂时染色都可以忽略这步了。。
2 ?- F  I8 j7 n还是后续的验证重要

franklinhg

一直都不高的假阳性率啊  其实很简单 A kit 里的试剂你非要拿到B kit 去用？难道人家公司是傻子， 会砸自己的招牌？ 明明一个试剂盒就可以的 人家非要给分成2个卖给你？ 不要想当然的改变试剂盒的配伍， 那会让你的试验拖很久的。

wang3033

x-GAL反应应该在8h以内，超过8小时，应该视为非特异性反应。

franklinhg

回复 wang3033 的帖子) f5 l1 f3 m0 \. m
' r# l: x& O: @! ~& n0 j  v
实验试剂盒不一样那么孵育时间就不一样  对结果的判断也不一样。
) g- g$ c7 G3 o: \4 c& _0 B9 V, h  Z我用的实验试剂盒 推荐是在20分钟到16个小时内染上色的都算是阳性结果。+ |, S' R9 ]5 S  t) ]  p; S( j* m( J
X-gal染色 和PH有关   主要是在配置染色液时候的PH和孵育时候的PH值。染色液PH一定要准确，孵育时候在一般的37度的微生物培养箱避光孵育就可以了，不用在细胞培养箱去了，因为其中的CO2会影响染色液的PH值的。

hnczlw48005

首先染色时间过长会产生一些背景。其次应仔细查看染色的地方，依我的经验x-gal最容易在肠胃组织着色。开始一直不明白因为目的基因不在此处表达，后来经过思考终于想通，x-gal染色原理是因为lac-Z酶的催化作用，所以着色代表检测到了lac-Z酶的活性，那是否是你转的基因表达的结果？我们知道许多细菌体内含有这种酶，所以如果有细菌出现也可能引起着色，肠胃组织中有大量细菌存在故很容易染色。