关于分离精原干细胞，给点建议

yuanyan2010

分离精原干细胞，据说小鼠的品系对细胞的影响很大；精原干细胞的培养液有好多种，不知哪位高手能提供一个自己用过的稳定的培养液配方；分离的注意事项，我分过一次是用129和c57的F1代，三周的；两部酶解后长到明胶上，文献上说七天后可以长成精原干细胞的明显克隆，但是我的没有长成，很可惜的是没有图片，请高手们给点建议。

blackbee

我现在分离人的，长的奇慢！

hualin840518

这个有现成的标准方案，建议参考这篇Nature Protocols
& S6 i% d3 E9 a# w4 wIsolation and cultivation of stem cells from adult mouse testes
" B0 v  q' Q# L/ x6 vThe successful isolation and cultivation of spermatogonial stem cells (SSCs) as well as induction of SSCs into pluripotent stem cells will allow us to study their biological characteristics and their applications in therapeutic approaches. Here we provide step-by-step procedures on the basis of previous work in our laboratory for: the isolation of testicular cells from adolescent mice by a modified enzymatic procedure; the enrichment of undifferentiated spermatogonia by laminin selection or genetic selection using Stra8-EGFP (enhanced green fluorescent protein) transgenic mice; the cultivation and conversion of undifferentiated spermatogonia into embryonic stem-like cells, so-called multipotent adult germline stem cells (maGSCs); and characterization of these cells. Normally, it will take about 16 weeks to obtain stable maGSC lines starting from the isolation of testicular cells.

hualin840518

回复 hualin840518 的帖子! s, }( R0 \- ?' R# ?1 V7 \3 T

8 s  ]: u% z0 L" x" _0 k# f/ |ftp://124.42.15.59/ck/2011-02/16 ... mouse%20testes..pdf5 n/ J6 p- j7 ~; J( P. K
这是网上免费的链接！) O$ L2 ?4 Q  Z' g
+ P- @5 t# K3 b/ z
论坛的链接如下:
" l6 X/ s- |1 |7 {7 V4 Shttp://www.stemcell8.cn/thread-46942-1-1.html

hcluo

建议用thr1（CD90）或其他的磁珠分析，条件好的可以选择FACS流式分选（需构建模型），这样能保证得到纯度高的SSC，对以后培养会很有力。每个实验室的条件不一，还得继续摸索。加油！

ying

呵呵～我2月8号分的，今天正在准备转到MEF上。我没用磁珠分选，就是消化下来直接铺上的。
/ Z7 K, y$ d4 z8 [) [0 e用的是DBA/2和 DBA/2×C57 两种，前者用7day后者用的是14day。感觉7天效果明显比14天好，克隆非常漂亮。我同时还用了C57的7天，完全相同条件养的，一个克隆都没长，可见品系极为重要。我用的是所谓“SF medium”，就是那个超级复杂的，基本没有改配方～ 没加LIF,孕酮，雌二醇。: ~7 o; {  \- D5 t3 Z! h

8 d+ y1 S! E$ O2 s; d  {4，StemPro34 SFM base  Invitrogen, 10639-011   培养基
6 X* w. D0 D/ M1 J' g. e" R- S10639-011; @3 b: k- A4 K
StemPro®-34 SFM (1X), liquid. h. P# G9 J% _" k; e% _5 ^3 ^
500 ml
1 B: a' a3 J" ^, v) x9 {8 y
8 L) @1 E* n) g. X; Ahttp://zh.invitrogen.com/site/cn/zh/home/Products-and-Services/Applications/Stem-Cell-Research/Hematopoietic-Stem-Cells/HSC-Stem-Cell-Culture-Media-Reagents/stempro-34-sfm.html/ v+ w+ ]7 P" T, m3 E- V; V

! [" S" G2 R. D- ^0 _" u5 G6 B) r* }
5，40X StemPro34 nutrient supplement  Invitrogen, 10639-011  培养基添加物
' R; g2 @4 N0 |, p& s- O这个和上面的4是一起的。* Y- s" A( C. J: z" Z
8 }3 [! }. r9 Q2 I/ o; C+ Z

% S) y6 ?9 x% B) [, K: z1 P6，Bovine serum albumin   Calbiochem, 126609   培养基添加物  final 5mg/ml* G  W* u) k. K- ]! i
, o) G; R9 y' ~/ j8 i; C
http://www.merck-chemicals.com/china/life-science-research/albumin-bovine-serum-fraction-v-fatty-acid-free-nuclease-and-protease-free/EMD_BIO-126609/chinese/p_oXeb.s1LbkMAAAEWTmIfVhTm?PortalCatalogID=merck4biosciences
6 q% Q! c, v4 Q
; S. z4 ]' m& D5 p$ m* @
" J4 m, X- c% S+ U8 |7，d-(+) Glucose  Sigma, G7021   培养基添加物  final: 6mg/ml" B7 Z7 B- I) w
9 {+ H$ @% J/ v! `7 b# ?) m' Q. P
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?D7=0&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&N4=G7021%7CSIGMA&N25=0&QS=ON&F=SPEC
. F' j+ @5 Q, y( G; @3 d: i1 ~. n! z0 R4 E: t0 s
8，L-Glutamine   Invitrogen, 25030-149   培养基添加物 . ]8 n# Q$ {1 t
; H9 c( r' B1 b% ^
https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25030149?ICID=search-product
$ u, B  J6 I* C* r1 N  f* w# l# y6 X8 o7 v8 E- ?" U
9，100X MEM vitamins  Invitrogen, 11120-052   培养基添加物. s+ X0 e' B- E. T% A2 l

3 j; Y, `# a2 p# Shttp://products.invitrogen.com/ivgn/product/11120052?CID=AFLBC-Invitrogen-111200527 Q% c; p4 t' f) y

1 E9 z% d* M9 G" N: A10，100X  Nonessential amino acids    Invitrogen, 11140-050   培养基添加物# c, G1 D$ d; H- T

6 ~5 Q$ a9 R5 z& X! T% x' bhttp://products.invitrogen.com/ivgn/product/11140050?ICID=search-11140050! N" H% W5 \) \
11，d-Biotin   Sigma, B4639   培养基添加物  final: 10ug/ml
4 v) H: d; @, ?7 M& d3 O  ]* @6 o+ z& d2 l- j  x* Q* R# i1 u3 b  Y2 Z' W
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?D7=0&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&N4=B4639%7CSIGMA&N25=0&QS=ON&F=SPEC2 c" Z$ }* \6 d6 p+ [
; r$ ^1 X- S$ ?7 }! ~/ c
12，Insulin   Sigma, I1882   培养基添加物  final: 25ug/ml5 R: x2 F7 Q; z* W+ j- G

0 V" T' L4 H6 ~. ~http://www.krackeler.com/products/sigma/SIGMA/I1882
* b- v2 H; R2 T) G( R" T* [: u9 N$ q
13，Pyruvic acid, sodium salt   Sigma, P4562   培养基添加物  final: 30ug/ml1 ~% W3 }, M( U7 G1 k: ]: P8 [
; ~! o: i1 _+ p; Y6 x
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=zh&N4=P4562|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC4 c( N4 Y6 O& _
14，dL-Lactic acid (60% solution)  Sigma, L7900   培养基添加物  final: 0.06%
- `; q& a# _# V- ^) O5 N! Q6 g: y( F$ d5 M6 ]6 _" l1 g
15，Ascorbic acid   Sigma, A4034   培养基添加物
5 ^$ e( F& I  S* i. J9 N  y) l: l; K. r2 P1 }5 a9 q6 @$ P9 E; v
16，Sodium selenite   Sigma, S5261   培养基添加物 final:30nM
5 K* J! K$ Z# E8 w: n8 T( T
) X' |6 K, z, M17，Putrescine  Sigma, P5780   培养基添加物  final: 60uM$ g$ U( U& g% o" J6 N9 ^8 D, j. Q2 N
0 ~# N! l% [4 E2 M- u6 c2 {8 M
18，Bovine Apo-transferrin   Sigma, T1428   培养基添加物  final: 100ug/ml4 v; F% W3 g# q1 Z6 P
19，Progesterone  Sigma, P8783   培养基添加物  60 ng/mL
, a# P! e2 [; B. ?; n孕酮。
9 }& X. [5 R7 G( P0 j* Z20，β-Estradiol 17-cypionate  Sigma, E8004   培养基添加物  30 ng/mL
# I0 N" G% Y  d& O- I0 r$ T雌二醇。0 i0 u' E% C' Y& V/ G# b- {
21，ESGRO (mouse LIF)    Chemicon, ESG1107   细胞因子  。
* r: j. |2 q& [1 k7 B" H% J6 {! `! q" Z
22，Recombinant mouse EGF   R&D Systems, 2028-EG-200   细胞因子 final:20 ng/mL0 O; z  D$ B$ f$ V

" x$ L+ p/ V( h2 lhttp://www.rndsystems.com/product_results.aspx?r=0&c=78&s=0&a=0&m=0&k=2028-EG-200&b=False&cj=-1&o=AND&p=0
! U, ]$ E0 `+ q' A% |! V( s% {. O/ ?# E5 e8 R4 G* t2 c
23，Recombinant human basic FGF  Sigma, F0291   细胞因子  final: 10 ng/mL6 s1 p6 Q- D* ?0 l# b0 b/ T  g

: b( j& |1 c7 H- l6 Dhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=zh&N4=F0291|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC6 \- p. D4 W* Z% N" o. k

" c- m' @/ f* f/ k4 m0 y! ^24，Recombinant rat GDNF  R&D Systems, 512-GF-050   细胞因子 final: 10ng/ml. G; H* I5 ~. ]% e1 _

, B8 A% F, S& k# k3 x& l; |http://www.rndsystems.com/product_results.aspx?c=78&s=0&o=AND&a=0&cj=-1&k=512-GF-050*0 r( A4 u) |, [) ]2 z; F

, V+ e8 H7 R7 e7 i25， 2- mercaptoethanol  1 i+ b* ~& g# Y6 N$ \

精神病院小萝卜

磁珠分选也只能富集大约10倍的干细胞数目，消化下来直接铺的话效果也是不错的，就是要注意观察，不能让sertoli和其他体细胞长得太多，一般会在第二天的时候把干细胞吹打下来，进行一次纯化。