ips全军覆没，我该怎么办？

rongrong

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2 f4 r3 @. A7 B; ^6 a, c( v# T  Z9 o* R2 R0 B( _1 q
还有那你们一般DMSO浓度到底用多大啊？

dilal

人的iPS细胞生长本来就很慢，既然有贴壁的细胞，为何不继续培养培养，看能否长起来。我们前一段时间买回来的miPS细胞也出现了这种情况，幸亏细胞收到后我们冻存了5管。传完代以后细胞大量漂浮，而且成团状，下面也有少量的细胞贴壁，换完液第二天同样出现相似情况。见帖子http://www.stemcell8.cn/thread-44333-1-1.html
9 J0 z" }/ w+ D) z# j当时怀疑是饲养层被支原体污染了，所以将细胞全扔了，剩下的冻存细胞一直没敢再养。最近一直在拿mESC摸索合适的培养条件。建议楼主暂时停下来，找到原因了再去养，查查是否有支原体污染或其它污染？

Yedan

回复 oucflora 的帖子2 F; Q; h; J0 g9 p+ g8 p
+ S, ~5 M: P* [8 A
您不是说LZ的10%DMSO浓度低了吗，所以我想请问您冻的时候用多少浓度，还有reference是什么。至于DMSO的作用就不用您解释了……

Yedan

回复 rongrong 的帖子. t! _3 n6 Q3 W% N2 `1 ?2 @! w7 y6 d
, K  |3 [& {1 p. z* ^
其实一开始我还猜测LZ你养的是小鼠的ips呢……: ]* j' D7 c; H; n( _* B/ s
你养的是人的ips，为什么会是单细胞？我们实验室都是用针划了传代的，不会消化成单细胞的，再说人的干细胞不能像小鼠那样打成单细胞的，养不活的……
* ?3 f+ ?7 S& q, A) l9 H

Yedan

回复 jefferson 的帖子! m$ N4 y) H0 b

* o0 s$ a- p1 r) R3 J" i! R2 I应其龙的2i不是用在mES的Feeder-free的culture吗，在复苏的时候有用吗？求reference

张也行

回复 rongrong 的帖子
6 d, v. K: ?* J
! E* h8 e3 ~( Q1 q# Y: s9 c我觉得是因为你复苏时吹打太剧烈造成的。你是高手，应该明白人的ES和iPS传代时都是传的小集落而不是单细胞，吹打的过于剧烈，小集落不容易生存，更何况是复苏的时候呢。( ]. `- ], ^/ R/ O" B
( c$ l# \( X$ i2 H' m7 w
很奇怪你怎么知道贴壁的是单细胞呢？人的ES或iPS细胞单细胞应该很难成活吧，应该是几个细胞形成的小集落吧。

rongrong

回复 Yedan 的帖子* P% [4 ]% k6 C7 U! d

5 q* a9 U5 H9 l0 |3 X:'(我是用胶原酶消化的，然后复苏时要洗几遍，不断吹洗，离心，反正就成那了，我也不知道，没有吹很多次的

rongrong

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$ Z# k  D  N) g
- S: |0 ]6 m6 {$ h  b4 S" o6 d恩，算是几个细胞的小集落，但是边缘没有那么明显的界限，估计都不行了，我现在想起要养干细胞手都抖，不知道怎么来呵护它，他就会好好的。。。唉1

张也行

回复 rongrong 的帖子) z3 o3 |9 {' B  _" ?4 W+ @

. F: e5 V4 b7 t. b6 o5 r做实验本来就是这样的嘛，没必要这么灰心。先不要扔掉，再等一两天，如果没有污染，说不定还是会长出来呢。

cicadacjk

回复 Yedan 的帖子$ }$ Q# [. h2 H" q+ n( t- E
( d: Y; _9 f) E9 O8 Y2 D- i
这位同志，你对DMSO那位版友反问来反问去也就算了，明显DMSO就是用10%的, \; E) s/ y. f  X0 w* X2 q) c
对jefferson就没必要这样了吧
, g  W" w$ I& T6 l( y' ]  J  iY27632是ROCK抑制剂，可以使人胚胎干细胞可以单细胞传代，能够把0.1%的复苏存活率提高到10%，我自己观察没这么多，但效果还是非常明显的。
# I- d# l! F' J2 P至于Qilong Ying的2i是指MEK抑制剂pd0325901和GSK3抑制剂Chir99021，是完全不一样的东西。
' a# i4 E. A  [( `
: D2 S! q; g% `8 f+ g/ M( Z按照WiCell的复苏方式，根本不需要离心，他们认为残留的DMSO对细胞的危害，还没有吹打和离心的危害大。如果的确需要离心，一次也就够了，晃一晃就可以了，除了吹起沉淀那下不要吹打。