ips全军覆没，我该怎么办？

rongrong

回复 oucflora 的帖子) |# q% n& j3 C! l
/ a8 u# g6 i2 g; a$ F9 d
还有那你们一般DMSO浓度到底用多大啊？

dilal

人的iPS细胞生长本来就很慢，既然有贴壁的细胞，为何不继续培养培养，看能否长起来。我们前一段时间买回来的miPS细胞也出现了这种情况，幸亏细胞收到后我们冻存了5管。传完代以后细胞大量漂浮，而且成团状，下面也有少量的细胞贴壁，换完液第二天同样出现相似情况。见帖子http://www.stemcell8.cn/thread-44333-1-1.html9 T6 Y; v. ~& b) ^
当时怀疑是饲养层被支原体污染了，所以将细胞全扔了，剩下的冻存细胞一直没敢再养。最近一直在拿mESC摸索合适的培养条件。建议楼主暂时停下来，找到原因了再去养，查查是否有支原体污染或其它污染？

Yedan

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  T1 [& {! M4 o9 b. R, j
/ r/ ^5 d2 R" a/ s" Q您不是说LZ的10%DMSO浓度低了吗，所以我想请问您冻的时候用多少浓度，还有reference是什么。至于DMSO的作用就不用您解释了……

Yedan

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( g) V) Z) p1 p. k% |
6 o! R$ P( J' Z$ o" N其实一开始我还猜测LZ你养的是小鼠的ips呢……
- a0 h( b, y; w- j7 |你养的是人的ips，为什么会是单细胞？我们实验室都是用针划了传代的，不会消化成单细胞的，再说人的干细胞不能像小鼠那样打成单细胞的，养不活的……
7 e" p: c( ]3 S4 m3 T# |

Yedan

回复 jefferson 的帖子# H5 P7 c0 E8 ?; j  m

2 o1 D& h2 X8 Z, e- u, N1 N应其龙的2i不是用在mES的Feeder-free的culture吗，在复苏的时候有用吗？求reference

张也行

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$ @9 _- R% r' W+ Y& p: n/ Y8 {- p0 ~' w* _7 l0 N9 x3 n
我觉得是因为你复苏时吹打太剧烈造成的。你是高手，应该明白人的ES和iPS传代时都是传的小集落而不是单细胞，吹打的过于剧烈，小集落不容易生存，更何况是复苏的时候呢。2 z: O3 V5 r& Q9 G
& C, s2 }, E+ g1 k! w/ {6 B3 N
很奇怪你怎么知道贴壁的是单细胞呢？人的ES或iPS细胞单细胞应该很难成活吧，应该是几个细胞形成的小集落吧。

rongrong

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$ X$ {" l2 Z9 d* r' W4 N# e
7 y  U) U  Y2 x9 [:'(我是用胶原酶消化的，然后复苏时要洗几遍，不断吹洗，离心，反正就成那了，我也不知道，没有吹很多次的

rongrong

回复 张也行 的帖子% k* h5 @/ ^. l6 j) _

4 _' `* }5 A. q& W. ~恩，算是几个细胞的小集落，但是边缘没有那么明显的界限，估计都不行了，我现在想起要养干细胞手都抖，不知道怎么来呵护它，他就会好好的。。。唉1

张也行

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0 C1 f  Q" v% F: ?7 ^) }) @
+ {: v4 w* i0 W做实验本来就是这样的嘛，没必要这么灰心。先不要扔掉，再等一两天，如果没有污染，说不定还是会长出来呢。

cicadacjk

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* W; |, }' I- K5 p
+ q6 i# }5 W8 f. K9 }3 c9 r: W! ]这位同志，你对DMSO那位版友反问来反问去也就算了，明显DMSO就是用10%的
1 h& }  K6 S: O3 r( G( E对jefferson就没必要这样了吧+ K' h/ m" H# p' A
Y27632是ROCK抑制剂，可以使人胚胎干细胞可以单细胞传代，能够把0.1%的复苏存活率提高到10%，我自己观察没这么多，但效果还是非常明显的。: x) z! M7 U+ T- x
至于Qilong Ying的2i是指MEK抑制剂pd0325901和GSK3抑制剂Chir99021，是完全不一样的东西。- b- J/ O6 f' N% I
# d& `% z+ U# {5 G& U  L) p6 K
按照WiCell的复苏方式，根本不需要离心，他们认为残留的DMSO对细胞的危害，还没有吹打和离心的危害大。如果的确需要离心，一次也就够了，晃一晃就可以了，除了吹起沉淀那下不要吹打。