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由于实验需要,打算从刚出生不久的小鼠(PD3-PD14)卵巢中分离卵母细胞,向大家请教一下分离方法,下面是我看文献整理的一些步骤,感觉所需时间较长,大家有没有其他的更为有效的方法?望不吝赐教,谢谢。
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5 C0 m. @' o! ^: x1 小鼠脱颈处死,取出卵巢,在显微镜下剔除脂肪垫和多余组织。& x9 z8 y, z2 r1 T6 p5 _1 A1 l
2 将卵巢剪碎,然后胶原酶消化,消化过程中不断吹打振动。$ x. w, v, N* ]; V
胶原酶溶于DMEM/F12培养基中,浓度为0.05%,培养基添加0.4%(g/ml)的BSA,100U/ml的青霉素和100ug/ml的链霉素," h( V9 T2 l* P7 U0 J {6 S U
3 大约40-60min以后,待组织消化基本完全,往消化液中加入EDTA至终浓度为40mM,然后于37℃孵育15-20min,期间不时搅拌,直到颗粒细胞以及其他细胞类型完全散开。/ s5 [! _! }: @8 T' J
4 将细胞混合液洗涤一次,然后于上述不加血清的DMEM/F12培养基中培养12h,使颗粒细胞和其他细胞贴壁生长,未贴壁的卵母细胞和血细胞被聚集到上清液中,室温1000rpm离心5min,然后血红细胞经过低渗buffer出去,(含144mM NH4Cl和17Mm Tris-HCl Ph=7.2)。
3 c1 Z' l; P/ _" g& ?5 洗涤几遍以后,离心收集卵母细胞,加入裂解液裂解后,14 000rpm 离心20min,4℃,取上清测BCA法蛋白浓度,待用。& Q5 j q$ h8 m4 x& E
. ?% ^; b* a7 y) _5 ] 具体方法参见: Pradeep Reddy, et al. Science,2008) q8 z' F: j/ W# {
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