求助！免疫组化测肿瘤组织CD133，阳性率太高怎么回事。

胖兜宝贝

我用SANTA CRZU公司的CD133单克隆抗体测的，CD133阳性率20%左右，在阳性的标本里面，无一例外都是高表达强度。1 A2 p0 h5 Q: v+ o
按照文献，肿瘤干细胞阳性率应该在1%以下，可是我做出来的阳性病例全是下图这样的，大量表达CD133.
* d' R; Q6 [8 @( T7 L$ J% Y* o9 ^4 r* L2 l1 o9 u4 \$ `: F
请教大家，会是什么原因造成的。

cneagle66

Santa 的抗体阳性率高是出了名的，建议更换抗体试试，比如cellsignal、sigma的，注意不要买到假冒的。

gandanxiaoyang

以前用的是美天旎公司的CD133抗体。
7 N0 Z" o* ~+ ^2 [需要提醒的是，美天旎公司抗体说明书上说，最好是用冰冻组织的切片做。
' M; \; n! g' q" b而且好像对修复液有特殊要求。看图片好像染色多位于细胞核中，所以染色特异性有待于进一步确定。& g8 x  t8 \% l$ r' R
如果不能肯定，可以先做几张冰冻切片，应该会好很多。

ljs

1.把阴性对照的图片传上来，先看阴性对照。, D: {# E$ p% @
2.你用的修复方式是什么？不同的修复方式及修复方法对阳性结果有很大的影响
, R# {3 Q9 u) l  x3 I8 @3.染色时间是多久？
/ z2 B+ p2 n2 z  J. s  w8 H/ B4.一抗、二抗的孵育条件是什么、种类属别别搞错。; g  y( i! n' V, |& r1 X+ K% B
总之，综合以上的问题，把各个条件优化到最佳。你的实验仅仅是刚开始，没有优化，出现假阳性有可能。

胖兜宝贝

回复 cneagle66 的帖子
8 A! V( p2 G, Y# i# L0 A9 K, m/ K6 h* ^
实验经费不够了，这个抗体花了2800买的。                                             

胖兜宝贝

) z8 u# ?5 T2 j, A7 {
这是阴性表达的。
& o9 @; W  |& i+ O# K: [( k! y修复方式是高压修复。
/ c! n2 M4 K, [7 e7 Y染色是用了Elivision plus试剂盒，一抗在37度下孵育1小时，二抗在37度孵育20分钟。

胖兜宝贝

gandanxiaoyang 发表于 2011-12-9 09:24 ; x) N, Q9 ?7 W* {9 K
以前用的是美天旎公司的CD133抗体。. U3 T" p! K: J1 ?% y) V
需要提醒的是，美天旎公司抗体说明书上说，最好是用冰冻组织的切片做。 ...

* K5 e( o' j: U  G3 H1 l  h- W
是的，基本上都是核染色，按道理是应该胞膜阳性的。但是还有不少阴性的病例。为什么有少数标本表达强度那么高，但是还有很多病例完全没表达呢？

胖兜宝贝

ljs 发表于 2011-12-9 10:07   Z8 D; \# Q; o7 e1 t( A) p
1.把阴性对照的图片传上来，先看阴性对照。
1 ~8 K2 z$ {5 c- U. S8 G3 l2.你用的修复方式是什么？不同的修复方式及修复方法对阳性结果 ...

1 n& U! ?' C& Y8 j# w% R
我在论坛里看到有人说这种情况可能是抗体浓度过高造成的，请问有这种可能吗？

ljs

抗体浓度过高造成的，有这种可能！！
; Q2 l4 y4 c9 s实验条件摸索的建议如下8 r% v8 ~5 _  v
1.一抗反应条件4度过夜，设置好不同的浓度梯度. l- e2 c7 y: h1 |% V
2.可以试试不用高压修复，或者减少高压修复时间，看看效果。; Z& |* e- Q) `# g& p# i; F
3.最后的显色时间、显色液的浓度应该降低。
4 ]5 t0 Q4 H* i1 n  c  L根据你提供的信息，这个抗体的阳性部位在细胞膜，针对抗体的建议如下：
" G$ W1 D. W+ P/ y0 K! ?1.更换抗体，从其他的单位找到这个抗体和阳性病理切片，即阳性片，国内很好买到，做着看看，应不成问题，没多少钱。经费不够不是理由，大不了自己掏钱。1 [% [3 e" T0 _: N
2.联系santa售后服务，要他们来解答。

胖兜宝贝

ljs 发表于 2011-12-9 14:53 7 q2 c4 L6 @! ~' S' b
抗体浓度过高造成的，有这种可能！！
4 l" h; t3 u) S, u7 i. C$ ~实验条件摸索的建议如下/ j1 i2 z$ Z- `+ Q- d3 d8 H4 d
1.一抗反应条件4度过夜，设置好不同的浓度梯 ...

0 O: P9 i2 P0 m6 \; L谢谢，我按照你的建议再试试看