关于FISH

idealgas

本人最近想要做FISH（荧光原位杂交），因为该技术具有直观性，灵敏度高，并且能够直接在染色体上显示出杂交位点和数目，非常适合外源插入基因、致病基因、染色体分析、转座子研究的检测。但是苦于手头没有资料，并且没有人做过这个实验，所以来论坛里面转转，看有没有大侠给出指教，或者给上部分相关的文献、方法等，从探针设计的原则、实验中需要注意的事项等等方面给出指点。谢谢大家。

hughliang

8 `4 E; K* }9 D+ E2 X1 ^

7 I3 T$ v; ], ~1 C- K4 H6 x9 f严格按这个protocol做，做不出来找我。

ambassador

hughliang 发表于 2012-2-8 16:11
8 e/ K" j1 E+ M1 L% @, n严格按这个protocol做，做不出来找我。

, G; A! K" J6 h1 U9 `  d
你好，你这个protocol的资料里面探针设计用的是缺口平移的方法，请问有没有用寡核苷酸链头端标记来做探针的方法？急求！

hughliang

回复 ambassador 的帖子
  z* X& K5 Q8 H8 O- q& S; P
# \9 Y) g. C4 V4 p这要看您的实验目的。
7 j2 H. E+ y) D+ b0 O9 _" x0 X5 E2 a' R& {) H3 u
我这个方案是指标记BAC或PAC克隆检测染色体畸变。由于靶点是单拷贝序列，只能通过缺口平移或随机引物法标记BAC或PAC克隆全长作为探针，否则信号太弱，无法检测。
0 @" O# [; Z! g6 h$ x

ambassador

hughliang 发表于 2012-4-8 13:57 " f, H( q1 ~& f0 p7 O1 U
回复 ambassador 的帖子5 ~' t/ f( }  ~& V9 j8 ^9 S$ V

5 G2 R% n- b; `7 I7 t* w这要看您的实验目的。

- P* }1 z/ _) f5 z8 F- N- H
嗯，谢谢回复！我只是检测他在染色体的位置以及拷贝数。。请问这个需要特殊的探针吗？普通寡核苷酸链能定位吧？

ambassador

hughliang 发表于 2012-4-8 13:57
$ k- L: w, A8 I, @回复 ambassador 的帖子' L% n) C4 g5 @$ C
2 }' [9 p0 ^7 M" p' Z% B3 v
这要看您的实验目的。

% E7 h6 [9 m0 Z, w, s3 l
嗯，谢谢回复！我只是检测他在染色体的位置以及拷贝数。。请问这个需要特殊的探针吗？普通寡核苷酸链能定位吧？

hughliang

回复 ambassador 的帖子
& y! k9 H8 t- m/ N( q' r4 a) Y: ~/ Z2 k( C/ C, u
得看您靶点的长度和拷贝数。
3 h9 B3 n3 R! x. N, j: R+ G0 _. N* ?( B
如果靶点是单拷贝基因，普通的寡核苷酸探针较短，即便标记探针全长也难以显示；所以得全长标记长达100kb左右的BAC或PAC克隆作探针。
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如果靶点是多拷贝重复序列，例如染色体着丝粒区域的微卫星重复序列（重复成百上千次），常用的方法是将该重复序列（几百bp）连入质粒，标记后作探针。7 A& Y1 h+ A3 a- V* T
. c: l6 l2 z' F+ @$ ^+ E' a+ O
所以，对于高度重复的序列，可以尝试寡核苷酸探针，但仅头端标记恐怕也难检测到。

weiyepan

头端标记信号不强，除非只是检测miRNA之类的小片段，不然的话一般不用。% J. V2 R' n. Y- [
标记方法可以用缺口平移，也可以用从头合成，另外按不同的需要分为DNA探针和RNA探针，楼主要的应该是DNA探针，用个klenow掺入标记就很好用，效率很高。可以用aa-UTP，之后喜欢标什么颜色都行，掺入很均匀。如果直接用荧光碱基标，不同的荧光碱基会有不同的混合比例，要慢慢磨条件很恶心。

vividvivid1225

回复 hughliang 的帖子" d8 M$ V  j7 c

9 D' X9 Q5 `* [' F4 P" k" l. lhughliang你好~
; x8 E: x( @3 E3 X. m- e我对你说的“靶点是多拷贝重复序列，常用方法是将该重复序列连入质粒，标记后做探针”不太明白，能否详细说明？, r/ f+ Q- _0 Z4 ]: b
另外，如何看靶点是否是多拷贝重复序列？是看基因在染色体上的位置是否是在着丝粒区域吗？

细胞海洋

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