质粒提取

wangwang1987

上个星期和这个星期 做了同样的质粒提取
& M0 k4 J- M) s7 E然后结果plasmid 的结果，nanodrop 测出来是 4.7和1.17 然后A260/A280是1.55和1.7。
9 {* [0 c0 D0 \' ~* m+ x知道其中肯定是哪一步出了问题，但是具体是哪里出了问题，真的不知道呢。
8 \# X% S, w- c% |0 E4 ]7 B补充说明，在提取结果为4.7的那一次的时候，同一批次的样品结果很正常，非常好。

LQAI2012

额 你这4.7是什么参数值啊……？" w5 [- A5 B4 z0 x
质粒的话A260/A280的值，1.55和1.7这两个都有点低诶，应该高于1.8较好

wangwang1987

4.7是浓度 4.7ng/L

LQAI2012

回复 wangwang1987 的帖子/ D; e$ J8 C! `6 q- z- h: e
  b8 F; `+ P8 f# m& P: i$ W- J% G6 l
4.7ng/L？？# P, c# G4 m7 E& r. y0 J9 X
应该是ng/ul吧？要是这样，质粒提取的浓度相当低了……. U' M3 c7 A' {! x# b* g% H" o! Y6 b
这么说 你说的问题就是浓度太低？% v. F/ |" e0 G- z1 O- f

& _! i8 k9 p1 f* q4 M如果是这样，可能的原因很多诶
1 L% \$ Y( l: w: _9 o首先，用于质粒提取的菌量是否足够？* \4 D6 x: t- C7 Z
然后，溶液二的裂解是否充分？! c+ V5 l( P, t1 g2 G
在最后用于溶解质粒的溶液（TE或水）的PH好像也很有关系（7.0-8.5），还有若是在50℃预热溶液会有利于提高溶解效率3 D3 f* |5 n$ R' o2 l

4 g  Q8 j" z4 G- h1 r0 c) i希望对你有帮助

mirrida

  4.7ng/L？？太低了吧，是不是单位弄错了.用试剂盒提取的话，我们提的浓度一般是300ng/ul!
5 i, r$ B2 g) i9 i- f, e$ q# P1 z2 m7 G  260/280小于1.8是蛋白含量高，可能你的细菌收集的太多了，或者是加裂解液后没混匀，影响了裂解。
- O0 h+ b& N+ a' `/ I5 ]  加裂解液时要完全混匀，你可以把去蛋白那一步多重复一遍。收集质粒时要把洗脱液滴到管中心，定量的洗脱液可分几步加，多重复几次。

mirrida

其实提质粒时，260/280小于1.8的，1.7左右也能转染，影响不大。

wangwang1987

谢谢各位 我的单位没有写错哈~所以我得再看下。想一下，因为同一批次提取的都没有问题诶~

holywater

很正常的，我还有中抽管子啥也没抽出来的时候呢，那叫一个心疼，好贵啊
" R2 R$ D% n* x# K5 }# L# l5 Y0 a: M7 V1 _9 g3 ], _) p
有时候抽的漂亮时候，50ml的管子半个小拇指甲那么多DNA，那叫一个高兴
6 ^2 l! ]- `9 O5 N4 ^3 @3 ~
0 s0 t) G' M$ J* M7 u管子，尤其是国产的，质量不是那么平均的。。。
; d1 l  z5 j+ z7 I1 x- `# g! b/ ]. O& R  g0 `

xiongjiedeng

A260/A280是1.55和1.79，不太理想呀，nanodrop 不一定靠谱，建议做酶切鉴定，如果与质粒图谱不符，就准备重做吧~~质粒提取的出问题主要子啊试剂与操作，操作要谨慎，试剂建议全部用新的吧~~

hany2007

建议：1.重新用接种环划线涂板，挑选单克隆。固体培养基抗生素浓度为：卡那50微克/ml，氨苄为60微克每毫升。
9 @( j& |- F. m+ |/ z6 r      2.挑取直径大于3mm的菌落，接种于3毫升液体培养基中，抗生素浓度为100微克/ml的。37度，220rpm，摇菌14h。' a$ M, K9 [' @
      3.菌液一旦达到所需浓度，建议马上开始提质粒。$ w# c5 \% Y" `' w
      4.洗脱时，建议把洗脱液温度加温到65度。8 o7 J, D1 w" D" E3 d
0 }) d) e1 I* R& B: Y
      关键是挑克隆，摇菌，提质粒连续进行，期间切勿中断。我现在用天根的试剂盒可以从2.25毫升DH5alpha菌液里提取到12微克质粒，浓度为80ng/微升。5 ~9 }5 `: Q  |5 D* m: `8 ~
      万一还是不行，建议你重新做转化。