有诱导过EMT的经验人士吗？能不能讨论一下，

小木梅

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8 r$ u# K3 ]# \) b: P! J" l, m
2 L1 l1 J6 T; N; l5 ?; q好奇请问一下，TGF-b诱导EMT转后，撤除TGF-bata，EMT的细胞会变回原来的E样吗？谢谢

一路顺风

回复 markllq 的帖子7 ~& a  t. G* `* f6 w. X% A

4 t# F5 N1 N! U3 F0 t+ t; \$ u希望您还能有机会看到我的请教。知道您诱导EMT很稳定，很佩服你。我现在也在做TGFb1诱导EMT，但是一直不太稳定，有时能出来，有时出不来，现在着急的不行，怕延期啊！
; h  S( S8 M* R0 {有几个问题请教您：加TGFb1时，是铺细胞的时候培养液里就加上，还是等第二天细胞贴壁后再加？
! b6 i2 q1 v% w% @0 `; Z( t, ^您的细胞接种密度是多少？您使用低吸附板子还是一般的板子？# L2 J5 }- P' F; }( {
谢谢了

细胞海洋

回复 一路顺风 的帖子5 F1 t- z1 \, F/ m4 Z" H

) M- c) y- D, n5 ^- ]3 k建议你发新帖提问

markllq

回复 一路顺风 的帖子- d1 q5 S3 F4 p0 q- g' f8 e

0 K/ T( L: d& }' L2 U不知道你用的是什么细胞系。我试过人的HMLE和鼠的Nmumg两种细胞系。鼠的24h之内就能看到明显形变，很容易诱导。而人的细胞响应会慢一点，可能需要一个星期。用TGFB1诱导的时候是需要加血清的，不然细胞会死，密度要稀一点，20-30%的密度比较好，细胞种下去悬浮的时候就可以加。细胞大概长到70%的时候就传代，培养皿普通的就行。

markllq

回复 小木梅 的帖子% ^. R+ ^# u- N) f9 [7 r
, t  u$ Q; v5 N" p8 S
看什么时候撤。早期撤会回去的，过了某个点之后再撤就回不去了。至于原因不是很清楚。我个人认为前期表观遗传改变不稳定，可能是早期只发生了一些乙酰化水平的改变，而到后期就变的比较稳定，可能是组蛋白甲基化都发生了改变。

一路顺风

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0 T/ o3 G& |7 c; ]  Q1 |$ F7 L9 `  ], G5 v9 J1 \3 G: i" ]# N
非常感谢您的回复！我用的人的HMLE细胞，这个细胞是无血清MEGM培养的，我现在直接把TGFb1加到细胞里。就是诱导不稳定，不知道是什么因素没有考虑到。谢谢您' ]4 X1 ~9 C) `% t/ Y( j
请问一下：
9 @, E# I( [9 s; `' z! f, M您在铺板之前，细胞需要饥饿吗？( _- q# S/ O. {5 ^! \
谢谢您！

markllq

回复 一路顺风 的帖子. k7 z# a' w& A4 N" A+ Z

+ H  B% z, w3 R- l3 ^细胞培养的时候千万不要加血清，当你加tgfb开始诱导的时候再加，这株细胞诱导EMT很低效，我觉得最需要注意的就是细胞密度，要让细胞保持一种松散的状态，一旦感觉到细胞有点紧密了那就赶紧分。所以我们一般隔天就分一次，这样大概七八天左右就能看到明显形变，继续诱导到大约14天的时候可以收样。不要让密度超过70%，细胞太密你加tgfb时间再长都可能看不到形变。

一路顺风

回复 markllq 的帖子3 S: J: W- m! g, v6 r

; D, _; }5 e2 C. d感谢您的回复！您的意思是诱导过程中，把细胞隔天传代吗？我平时养的时候是隔天传代的。
, _$ d. \8 u0 _谢谢您

markllq

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3 F: r# A' c, J) O" p( }. f2 h1 Q& K$ p( W, [. |
是的，保证密度较稀，不能等到长密了再分

一路顺风

回复 markllq 的帖子' ^7 t- C/ _- k* l9 x0 P2 X& Z
: S) L" J4 I& _) g9 M
奥，明白了，这个我尝试一下。谢谢您！还有一个问题：您加血请的浓度是百分之几呢?
! D  i* N& Y% }2 g, Q能问一下您用的诱导培基是什么吗？& V6 `2 l( n1 S! n7 Q1 H
非常感谢您!