PCR搞不定了，丢脸啊～请各位高人指教！

ying

回复 hndxws 的帖子! d3 l1 X& G& b2 n9 _

8 z6 q7 w0 W5 j, L/ c0 T7 Q忽然想起了我当年的亲师父给我的Tm简单估计的软件（网页版），自从他毕业了我就自以为有经验了，就忘了他的宝典～今天算了算，果然只有41度多点儿啊～惭愧惭愧！被CG搞花了眼，搞错了主要矛盾啊～
6 L6 g/ a# |& R$ U9 W1 Z' S. W. R. ?' U不过话说，有人用36度退火么～俺去试试～ 但估计也不行，这回就该CG捣乱了～不管了，试试再向大家汇报，当然，引物先订出去～

sykbod

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4 R8 |5 }1 G3 ?6 N" \, {, c* A. y, b  g! P( A
generally, if you have tried different annealing temperature and DMSO and it still not work. I prefer to design another pair of primer. You may want to use longer 5' primer.
* U6 B3 y1 I% W5 D. K/ m5 W$ ~$ u4 ~: q& t2 N8 L3 o2 Y
Good luck.

ying

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% ]9 P3 j& V# H7 p( f) k8 M6 k, t
# R( @9 V1 T9 C  Y; P% t0 r- M$ ~引物已订。非常感谢您的热心帮助！

石山巨石

加betaine 试试 68度多跑几圈 (比如60)

ying

订了个长引物，同时用KOD-plus和KOD-FX，结果只有KOD-FX得到了条带。估计一开始是因为引物太短，之后是因为KOD-Plus的体系仍然不能扩增这种高CG的序列。终于得到了。哎呀～疑似软广告了啊～

leozarah

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. j: N3 {3 z; V
/ ~9 R1 P5 C- e: d楼主，你好，我最近也在P这个头疼的CAG启动子，都试了好几次了都没搞定，可以把你的引物和使用的酶，以及设定的具体参数发给我不（or 我邮箱：zh_liao@163.com）？？？感激不尽呀~~~拜谢!!!!