PCR搞不定了，丢脸啊～请各位高人指教！

ying

回复 hndxws 的帖子# [+ q2 C3 r8 H/ F) @

( q, B2 S5 I+ ~+ X3 j# Q0 ^忽然想起了我当年的亲师父给我的Tm简单估计的软件（网页版），自从他毕业了我就自以为有经验了，就忘了他的宝典～今天算了算，果然只有41度多点儿啊～惭愧惭愧！被CG搞花了眼，搞错了主要矛盾啊～  L# L9 L2 \( o1 u0 r, G
不过话说，有人用36度退火么～俺去试试～ 但估计也不行，这回就该CG捣乱了～不管了，试试再向大家汇报，当然，引物先订出去～

sykbod

回复 ying 的帖子3 D( x' D4 R9 i$ Y. C

: @- \" Z# ?1 O- |0 B' ]6 Vgenerally, if you have tried different annealing temperature and DMSO and it still not work. I prefer to design another pair of primer. You may want to use longer 5' primer.
/ w, u! v3 b; |' K! ^$ K; S; {$ B  r$ D8 G' i) c
Good luck.

ying

回复 sykbod 的帖子
: h+ D, x# C$ s  g9 x' U2 Y5 A' Z. ^0 K9 H  k  O) U9 O$ F  g5 \7 w
引物已订。非常感谢您的热心帮助！

石山巨石

加betaine 试试 68度多跑几圈 (比如60)

ying

订了个长引物，同时用KOD-plus和KOD-FX，结果只有KOD-FX得到了条带。估计一开始是因为引物太短，之后是因为KOD-Plus的体系仍然不能扩增这种高CG的序列。终于得到了。哎呀～疑似软广告了啊～

leozarah

回复 ying 的帖子7 g- U# W! Y5 x* t
4 x6 q% \$ q/ o4 ?
楼主，你好，我最近也在P这个头疼的CAG启动子，都试了好几次了都没搞定，可以把你的引物和使用的酶，以及设定的具体参数发给我不（or 我邮箱：zh_liao@163.com）？？？感激不尽呀~~~拜谢!!!!