PCR克隆基因，引物没错，没有产物啊

daviddow

PCR按照TAKARA试剂盒（DR101S）, 加入MCF7细胞的cDNA量3ul（我试验结果显示MCF7细胞中Notch3高表达）,其他按照试剂盒。设定的循环是： 94℃，5min; 30 cycles of  98℃, 10s; 50-62℃, 15s; 72℃, 2.5min; 72℃, 10min；4℃, →. 试验后琼脂糖电泳，从左边的marker算起是50℃-62℃,1%琼脂糖。* s1 H) G7 b7 h" i' X/ U8 v" J
结果如下：+ w$ [5 c# W7 l! Q3 H# a

; k* h+ V: Z6 @( @9 r. C1 oPCR没有任何产物，应该是1979bp。讨论：1）引物没错；
: B% G5 J5 X4 N9 N2 Y8 |The forward primers: , ]- L" a( ~: E
5’-GCAAGCTTGCCACCATGGTGGCCCGGCGCAAGCGCG-3’ 1 H0 h4 k8 [, M; F6 D3 I4 n/ }7 h
and
' R0 o5 r+ N# T$ b$ ethe reverse primer 5’-GCGGATCCCAGGCCAACACTTGCCTCTTGGG-3’
$ Y: r9 a1 S' T7 k7 k5 |
9 [, [$ M/ u% R4 b) ?大家帮我分析下原因吧，谢谢, m6 p0 J* V* [* R. s) x
6 R- U$ ?* l( ?" J2 u  }# P9 R

/ a' i% n1 `7 B! R  u/ ?: d

qiuweiqin0618

样品浓度较低？

daviddow

试验要求用小于200ng，我用了400ng。cDNA测定了浓度，

luoziwei

分子实验失败的原因，很多很麻烦。每次实验都需要设计好对照，不要嫌麻烦。否则，得不偿失啊。

xiphias

回复 daviddow 的帖子9 E8 u! e- ?: A9 V7 R& ]+ |

2 J8 c# n  u: W+ Z, E两条引物的Tm值差别过大，GC含量高。& s5 l6 k6 [! @2 y: U/ G: _+ Q
建议优化引物、和加入DMSO浓度梯度。

linzi214

Takara的高保真聚合酶给的PCR扩增条件好像都是两步法的，直接是98°C 10sec，68°C（按照扩增片段大小设置扩增时间，1979bp设置2min就可以了）。另外RNA抽提和cDNA逆转录有没有问题？cDNA含量高不代表逆转录得到的目的片段含量高。另外换其他细胞或者样品cDNA，并且同步扩一个内参基因看是不是模板和引物的问题。如果楼主要扩增的cDNA结构比较复杂难以扩增时，可以考虑分段扩增，最后将产物纯化后作为模板再PCR扩出整个目的片段。

youzi821

我认为引物的问题可能最大，引物不能简单说对错来衡量，而是要看引物设计的质量的，你可以用primer5优化下引物序列，或者DNAMAN看下引物情况，包括Tm值，引物3‘端是否容易形成节环。

weiyepan

50~62做的是梯度PCR，引物足够长，Tm应该比较高，PCR退火条件没有问题。
. U% v1 b/ u" o问题在于：
7 u. S8 q. h" ~5 Q( [1. cDNA并不是加的越多越好的，400ng我不知道你做多少微升的体系，反正我感觉加个50ng就够了，你做个稀释度下去，肯定比你加的多要好；
( i- S6 d, \8 o9 o3 B2. 你所说的高表达是QPCR结果还是WB结果？如果是QPCR结果可能这样的情况就比较诡异了，如果是WB结果可能是你RT没做好。
# J5 d2 \' b" F2 d0 H6 I, \/ b# f3. cDNA的浓度不知道你怎么测的，如果是电泳的话，结果比较可靠，如果是读吸光，那偏差就大了，建议跑个胶看看。

daviddow

谢谢weiyepan了

daviddow

谢谢weiyepan了