请教高手：怎么才能做出好的ＥＢ呢？

刘森泉

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( V; B/ c) f' d: O& n$ V1 {& @3 M. m+ Z% q
好的，谢谢你！

刘森泉

回复 wwy551 的帖子" b2 h) t0 i8 L) u% g) D0 b" L2 q

& O6 w& n8 @7 H' Q+ e请教下，养的hES很容易分化，而且一些分化了导致传代之后就有很多分化的，恶性循环了。想用枪头在显微镜下一个一个挑，但是今天试了下，实在不行啊，这么多克隆，很难挑啊。有没有好一点的办法？谢谢。

wwy551

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: G" g# q! \/ e" R4 ]4 F你这种做法治标不治本，建议重点想办法调整ES状态。% K# u' W# W; l* e/ B3 j9 O& K2 {
问题可能出在你用的MEF上。不知道你用的feeder是原代的MEF传到几代做的，建议不要超过三代，而且每次传代的时候比例不要太高。或者你可以适当提高你现在养ES的培养基的bFGF的浓度。总之，不管接下来要做什么，一点得先保证ES的状态很好，不然做下去的话也不会有像样的结果。祝好~~

wwy551

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' p; O) P: ^& W' I. f) b2 X0 O( x' \" u! f, L! E
你这种做法治标不治本，建议重点想办法调整ES状态。
5 p/ b1 M1 f! P2 Y$ n问题可能出在你用的MEF上。不知道你用的feeder是原代的MEF传到几代做的，建议不要超过三代，而且每次传代的时候比例不要太高。或者你可以适当提高你现在养ES的培养基的bFGF的浓度。总之，不管接下来要做什么，一点得先保证ES的状态很好，不然做下去的话也不会有像样的结果。祝好~~

刘森泉

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7 B) r/ j1 \+ o
谢谢。我用的是CF-1的MEF，5代之前，ICR的也用过。bFGF用10ng/ml，perotech的，那接下去提高点浓度试试。

wwy551

回复 刘森泉 的帖子$ d0 G5 h2 H' d8 G

1 l4 M+ s: o; e1 X9 v/ j, N8 e你用的bFGF浓度正常，MEF有点过了，别传到5代再用，四代都勉强吧，最好用三代的，这样的MEF状态会比较好，分泌FGF的能力比较强

刘森泉

回复 wwy551 的帖子6 N* ]9 T& m, x/ U4 k

1 B. C; s0 d3 h( F  ?4 ]你刮细胞使用移液管吗？还是1ml枪头？我昨天用枪头刮了ES和iPS，今天看了下，看不到克隆啊，都是散的细胞了，要么是分化的团块。最近养ES养的头疼，很多次请教你，麻烦了。

wwy551

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; H' L# G7 _  f. m5 K5 N
+ Q0 j, b7 e/ e: r7 s6 [- s我们都是用1ml的移液管刮克隆，当然你消化克隆的时间也得足够，看到克隆边缘卷边的时候再刮。刮的时候，移液管垂直培养皿底面。枪头的话对细胞损伤太大，我们从不用来刮克隆。

刘森泉

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( X: l2 w9 U0 `3 B* [- G5 h6 ]- B- N
6 f: a1 S: R. k" r' F7 N; J分散酶消化后，用移液管在显微镜下一个个刮还是大范围地刮克隆呢，如果没有目标地随机刮的话是不是不用酶消化啦？

wwy551

回复 刘森泉 的帖子) E7 @) c2 w* }9 v/ c

: y  K! v$ Y# I* W0 ]1 U" S就常规传代ES的做法操作就可以啊，不知道你平时是怎么传代的