关于FISH的几点疑问

vividvivid1225

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) T& E, V& ]' `1 r+ m; z% v最近计划做FISH，我是新手一只，有以下几个问题相向各位请教~( G; G- i% r! w
  首先是杂交位点的选择，我做FISH的目的是区分人类细胞与兔细胞，因此需要找到一个人类特异性的基因。但找的同时还考虑到杂交信号强弱的问题。根据现在查阅的资料，alpha-satellite DNA是唯一一个存在于全部人类染色体着丝粒的DNA家族，杂交时可产生强信号。X染色体在Xp11.1-Xq11.1上存在有alpha-satellite DNA。我在NCBI上找到一个人类基因（homo sapiens），位于Xp11.23，所编码的蛋白质在网织红细胞形成过程中起到重要作用。我现在有这么几点疑问：1.我们的细胞在体外培养过程中很可能发生了变异，因此不确定我找到的基因在细胞核中是否存在。我该用什么方法来确定？2.如何确定位于Xp11.23的这个基因是否具有alpha-satellite DNA？
  V3 l7 _$ _/ Z8 M/ h  u请大家不吝赐教~

weiyepan

你的表述我理解的不是太清楚：$ s' V0 D  }! w: o+ b# J( m8 z
alpha-satellite DNA我的理解是在着丝粒的重复序列，我不知道你所说的基因是什么，homo sapiens你去词霸查查是什么意思先。
: Z/ G* r6 x2 Z: L/ `! |4 a而且基因和着丝粒扯不上吧。。。再说了，验证基因在不在做个PCR就知道了，不知道你要做什么方法标记的探针，但特异引物总得有吧，标记的时候也有用。。。

vividvivid1225

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5 ?0 b. o% q; G7 x. d7 ?
# }- O/ J; R+ ?6 L- O0 w感谢~. W) z" V* {* I3 x
我是FISH新手，很多东西都不太清楚。homo sapiens是人类，现代人的意思不是。。
* C4 t2 R, D; t5 Y% r5 G  d6 K$ `) z4 ]我的意思是想找一个位于X染色体上的着丝粒重复序列区域的基因，以便于之后的探针杂交产生强信号。现在我找到了一个叫做GATA 1的基因，位于Xp11.23，想要根据这个基因序列合成探针。8 \7 P! e6 X7 g% G% E
我的目的是区分细胞的来源（人的还是兔子的。。），GATA 1基因在人和兔子X染色体上都有，blast比对之后同源性为83%，请问我可否根据这个结果选取没有配对的区域序列设计探针？
1 P  [* Z3 A  y" R/ W2 s; t, m% F另外对你所说的PCR验证基因不是很懂，能不能详细说明一下？

weiyepan

我不知道你的这个课题为什么要这样做，区分人还是兔子的细胞来源只要做一个胞膜的蛋白免疫筛选就可以了，不需要搞到FISH这么麻烦，耗时费力。
- C: v: j5 ^+ t& V& A1 s: VFISH最难的其实就在于探针序列的选取，特异性是最重要的。其实不一定需要有和没有的区别，一个细胞内的丰度也是可以区别的。同样是哺乳类的，你要从特异性区分开来可能很难，最终导致信号不够强，你选的话就挑些重复性大的区域就行了。通常一个基因的区域信号是不够的，商业化的都是几个区域合起来用。
- L- O9 b7 `0 I" f* ?5 ^+ b另外PCR验证就是设计一对你需要的基因的引物，裂解了细胞直接扩增检测就是了。阳性就有，阴性就没有，就这么简单。

vividvivid1225

+ l6 V9 H$ ?/ j& C4 N
' P7 O) x6 C5 y; i' C: W7 a回复 weiyepan 的帖子' ~0 q' Z" Y7 U' a% C

* V. J- A( r& r# M感谢回复~, H( S! j& S7 ~5 [0 x  F) k$ [
请问胞膜的蛋白免疫筛选是指什么？能够在石蜡切片上检测吗？
: M, M) i' g, I0 K% ^9 i0 T通常一个基因的区域信号是不够的，那我在设计探针的时候是需要将多个基因的序列都作为模板共同设计一个探针吗？
4 h* p0 C: A, B; @2 G4 N3 Kps：请问通用的设计探针的软件是什么？oligo可以吗？另外如何判断基因在细胞内的丰度呢？
+ `4 `9 v. e- v( J1 _, D& ?感谢！

weiyepan

如果你要在石蜡切片上做，你去找一下免疫组化的protocol就可以了。抗体的话是很特异的，你找些膜上表达比较多的抗体比较容易买到的就行了。7 L) H/ Q% F( i
探针设计你去google搜索FISH probe design就有很多出来的，如果英语过不了我也帮不到你。一般都是直接找基因组的区域整段标记，要做到信号清晰，起码要10K以上的长度，一般商业化的都在20K左右。你如果要做的话建议你去看一下一些商业化的探针，他们貌似有设计的路线可以参考。

vividvivid1225

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! b+ W2 U3 I" C: `' I1 Q% Y" h
: R7 N2 _* u+ _+ H8 W% Y感谢~
$ J8 k( a* E3 ?' a我想问不借助公司的力量能自己进行基因组区域整段标记吗？我想标记Xp11.1-Xq11.1，我现在不清楚是怎么个过程。是要在去区段中选择多个基因联合设计探针吗？谢谢！

weiyepan

先更正一下我上面说过的，商业化的chromosome探针在100k以上。
- V1 F) @, a9 q如果自己要做的话，需要下面其中一个作为模板：
0 a* ?) v. C0 f: Y  B  t1. BAC clone
+ j# N5 g4 X- }, j! H- z2. 染色体片段( @# d' \+ m& ]: l3 G- F
这两个东西自己都是比较难拿到的，都是需要出去买。
5 R; D' I& {" O8 n& m! w: M你自己有时间的话可以自己拿基因组每3~5K设计一对引物，可能需要个10~20对左右吧（区域重复一点也不要紧，特异性高一点）扩增出来做模板就可以标了。  g7 y: D! ^, @) ?" b, c
不过和兔子同源性大不大就要你自己设计了。

vividvivid1225

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4 C" y' ~& |, P2 J' I  R# m( u  Y3 e( x; x6 s
感谢！

vividvivid1225

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: }$ z: R* m2 [1 E4 S: z
2 D0 a4 ?! @8 C0 J' v) K& o  g你好，请问你说的特异性引物在探针标记是也有用是指用随机引物法标记探针吗？
) ^9 f2 W5 \9 t8 U. Y7 {探针的合成能不能设计引物后通过PCR合成？
9 @+ i, `& M+ @! \* u3 ]8 O& b) R$ _# \8 F寡核苷酸探针如何合成？
6 c% c& q) T( S感谢~