大鼠脂肪间充质干细胞的提取

future007

本人最近做了一次大鼠脂肪间充质干细胞的提取，但是结果失败，在用胶原酶消化完脂肪后，穿过细胞筛的液体中基本没有我想要的间充质干细胞，培养24小时候也未见梭型细胞，下面是我的实验步骤，望大家给出你们的建议，我哪里不太正确。实验动物：六周SD大鼠% V5 S1 H1 o% \: i: U0 P
实验材料：手术器械、75%的乙醇、PBS(-)、I型胶原酶、200目细胞筛、0.25%胰酶、DMEM/F12、FBS、15ml离心管、50ml离心管、培养瓶、DMSO、滤器、0.83% NH4Cl
3 F6 T* H! K. U: L6 Z& V0 h  g实验仪器：15ml离心机、显微镜、CO2培养箱( k0 Y* u) P9 w- K" z
实验方法：
* k6 K5 x/ ^0 @4 z1.        取6-8周SD大鼠,脱颈处死, 75%乙醇消毒
# j+ q! C# K9 \  G5 G, x1 s7 s2.        取腹股沟部及肾下1 g脂肪组织: g" u  v* E2 {: B2 h' C6 y5 g
3.        用含高浓度抗生素血清培养基溶液清洗三次- `( Z- q9 H, i* |7 O3 D! Q% N2 K3 [
4.        去除肉眼可见的血管及其它组织
4 ]6 k/ C  }- P5.        用PBS(-)反复冲洗3次
, G0 A( O: k' c3 N7 B* ]% r/ u6.        用剪刀将脂肪组织剪成大约1 mm3小块
" r4 n9 Y0 v) Z8 T7.        置0. 1%Ⅰ型胶原酶中, 37℃消化60 min
* I% u8 Y, ]1 b8 P( N8.        用100 mm mesh过滤以出去组织块# K; ~- O* v) f4 q
9.        用PBS(-)洗涤两次5min 260×g，以完全出去胶原酶/ s, z+ t: s3 c& z  r' }0 ~) k
10.        用DMEM/F12+10%FBS双抗培养基培养在培养箱中
- T% c4 v2 B% J1 A) G: R* h9 `首先我自己分析的问题是我的脂肪剪得是不是不够碎，其次我的胶原酶工作液在4度放了3-4周，可能是胶原酶活性下降的原因，所以导致细胞没有消化开。大家请给出自己的判断，细胞图片镜下看就一些漂浮的血细胞，我就不上图了。谢谢大家的帮助
, \+ m7 \6 f' f7 ^2 F8 {7 [
6 r$ y2 B* D/ i  ~0 X! x9 M

漂泊的风

我觉得是你消化的时间太短了，我们是消化过夜，细胞长得很好。

future007

回复 漂泊的风 的帖子" I, W: r( b6 F3 K! m: a  ~
3 s  g8 P. I+ f0 I& x
我查的相关文献最长也没有超过一个小时吧，你消化的是脂肪细胞吗？

future007

今天第三天我的脂肪间充质干细胞长起来了，刚开始在镜下就是一些细胞的碎片可见，第三天居然长起来了，希望大家做的时候不要心急，放两三天再下结论。

hanchao

谢谢，恭喜。

zhouyonhzhan

想问一下你们培养脂肪间充干细胞的培养基加生长因子了吗？