新手求助，慢病毒转染是有荧光，病毒浓缩后做滴度实验没有荧光

sirius_zou

本人新手，向各位求教。/ p1 r$ {5 Y1 I9 P/ j% }
慢病毒在293T包装48h, 72h后都可见荧光，收集培养液经过滤、离心浓缩后，再感染293T做滴度实验，为神马就没有荧光了。: W1 Q; F  T0 y$ g6 |1 }
助转剂也加了的，是否是因为293T老化？用的是14代左右的293T做滴度实验

ying

我也遇到过这个问题过，然后同时换了细胞、血清以及DMEM培养基，之后就又包出来了。至今不知何故。建议你找个你附近正在包病毒的实验室要一些细胞血清以及DMEM。

birdflubirdflu

回复 sirius_zou 的帖子; Y2 P$ e/ L1 H2 P4 [" K
* E/ c7 q& w1 {+ x# L( {6 K
有可能是你离心浓缩的步骤出了问题，导致后面感染失败。

刘森泉

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7 v, |9 {, ]% f1 o# l& c* p+ K( E! l) |
质粒转染细胞第二天有荧光是瞬时表达，后面收集细胞液感染细胞没有荧光说明病毒没有包装成功。问题可能出在辅助质粒，转染试剂，病毒收集和浓缩过程。

sirius_zou

biowit 发表于 2012-8-15 10:35
% f2 d. Y! w: I* `1 r# x; T9 U细胞状态会影响滴度测定，必须保证细胞的状态良好，增殖快速。需要排除几方面
9 H/ ]9 A, F8 |" E* o! a细胞状态，% T) X1 I# \" D1 {, N: I+ d2 U
离心浓缩病毒的 ...

' T1 T3 |& W' K8 J  z- [
收集包装后48h和72h培养液，离心，取上清经0.45um过滤去细胞碎片，25000r/min 10℃离心2h，用pbs按离心前体积浓缩100倍得到病毒液，然后病毒液再稀释5-20倍用于滴度实验
+ H" |- l* B' ~3 E" ]6 j- R不知各位的步骤怎样？
9 m/ A: {2 s% q8 h1 i, C! @
7 Z$ D+ [/ }  R7 \* n- i" m补充内容 (2012-8-15 11:20):
& M) p9 {: ^% P293T增值速度的话，200+w细胞接种至9cm皿，3天基本长满

crystal_xjw

那可能是收集培养后续的步骤出现的问题，导致了其丢失；也可能是荧光猝灭，那么长时间，荧光自然也就没有了；或者您的浓度太低了，相对，可以重新试试。

weiyepan

辅助质粒有阳性对照么？哪个公司的产品？
6 o+ e% @: J0 E+ l7 f$ u; I看来这问题不是我们才有啊。

wwy551

这种问题基本可以确定病毒没包装成功，转染的293T能看到GFP表达，只说明带GFP的质粒转进了293T，并且表达。这不说明有病毒合成。浓缩病毒之前取一点包装病毒的293T的培养液，直接感染靶细胞，看看有没有GFP表达。有的话则说明有病毒，这时再做浓缩不迟。

flywithiyiy

慢病毒在293T包装48h, 72h后可见荧光，只能说明包含有荧光基因的质粒已经转染进细胞并表达。但是要形成一个完整的病毒，除了含有目的基因的质粒外，还需要生成病毒包装蛋白等辅助质粒。几种质粒合成的蛋白有效组装，才能形成一个病毒。所以只从荧光角度看，不一定说明有病毒产生。另外，即使有病毒产生，放置的时间和温度都会影响病毒的活力，导致感染不成功。

lchanlon

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0 a% T6 s: `# ]$ g3 N, S( v* u. \
Which reagent do you use for virus packaging? what is the ratio of the three vector? How much total DNA do you use.If you transfect 293T cells using only your transgene vector without packaging and envelope vector, you absolutely got the GFP positive cells. So you'd better specify your virus packaging protocol. Give very detail to other.