脂肪干细胞养不出来

loveless

养了快3个月细胞，可是还是没收获。实验步骤都是按以前师兄师姐做的，怎么就养不出来呢？还请各位指点一下$ e! w3 g3 R& S! K- Y9 _7 [
我的实验步骤：/ U) p. x# Q! M# w7 ~9 S! {
  1、处死小鼠，75%酒精泡5min。; G5 Y4 E  }0 L8 x6 H' F5 i8 F
  2、无菌取腹股沟处脂肪，放入D-Hanks液中，反复冲洗。
$ I) ~! v. |: ^. w; H4 p  3、剪碎组织块，呈半流质状，然后加到离心管中，加入1ml0.1%胶原酶，37℃，30min，不停的震荡。
; [, g9 ~/ ^& B6 c0 P: ]! U. }+ g) b  4、加入血清终止消化。离心，1300rpm，10min。9 a* t3 t4 }  ?0 ~, P7 i/ Z5 l
  5、弃上清，加入2mlDMEM，离心，1000rpm，10min。
( p9 X, A( o. A3 r  6、弃上清，加入全培培养。
: O: g: ~7 ]/ N8 ~- C: d3 q+ X4 w- V. C! w, o
按这个步骤做了好久，没养出来，还请大家看看那个地方出问题了~~~谢谢！！

amberma

几号胶原酶？如果4号 太温和了 30min 时间太短3 u5 F& M2 W" F3 P( f2 l
试试胰酶10-15min9 l& ^5 L; A7 j* e$ a5 w& o

loveless

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, G  o; X; U" D/ G9 J% d7 S8 C. N% B/ R. U
我用的是I 型胶原酶，30min。

willing

是没有细胞长，还是什么情况？

loveless

回复 willing 的帖子3 G: A, Z0 O% Y3 Y, W

; v" c3 Z$ A3 B( X* ^有细胞，但是很少，而且生长也很慢，原代十几天都不见长。

都市青蛙

每次你能取到多少脂肪组织？( a: U0 a9 p( i& i3 q
有没有留心胶原酶的作用浓度是否合适

tangyihan

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# ~: x' M$ B1 c+ O+ E0 \
. W* m2 K+ `* _* }9 b- j+ q可以考虑:+ ~2 {" ^+ i+ T3 T( |
1.用0.2%胶原酶。
" Z3 U) l. \7 f9 V. o2.消化时间延长为1小时，这也是nature protocol上建议的消化时间。  Q0 h- w8 t% \# `" p  v
3.离心后用100um filter 过滤。
" d! j9 M3 x4 W; S) l# H4 \4.你应该把步骤些详细些:不停的震荡是什么意思？没见过protocol这么写的。
" ~+ K) A5 \; V2 @5.发帖之前建议先看看其他帖子，园子里多着呢。- B, @- P) O( K1 U6 e$ D

' W1 p/ Q  d! w, E4 }祝你成功！

loveless

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" A: Z( K' Y+ G0 X( v; l
  L4 c" |4 O. `! W' p( o我用的是4~6周的小鼠，一只小鼠取到的脂肪很少，不到1ml。0.1%不合适？请问你是用多大浓度的？

loveless

回复 tangyihan 的帖子/ F4 D& [" m  F" F" z1 l$ z: M

' {# U! c$ s% a请问你说的“消化时间延长为1小时”是指用0.1%的胶原酶还是0.2%的？“不停的震荡”就是用手一只晃，因为没有水浴振荡器，所以就人工震荡~~~~

tangyihan

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8 [( u4 V$ Q. m# G/ h* P. ~3 U& ]/ x* g$ Z9 i6 g
用0.2%的胶原酶消化