DC细胞的培养方案和流式检测？

hwlightning

1、准备新鲜的外周血单个核细胞（PBMC）。* G- `- u/ `7 B% P: k3 E
2、将外周血单个核细胞在铺在培养瓶中，用加入25 mL免疫细胞无血清培养基8 W" o$ q, O4 C. u( p, l/ ?
3、在37℃，5％CO 2的潮湿培养箱中孵育2〜3小时
2 U- l1 M8 ]4 s9 X, \4、弃掉含非贴壁细胞的培养基! K( M, s- {8 c, N
5、添加50 ng / mL的重组人IL-4和100 ng / mL的重组人GM-CSF
4 c7 `6 l0 m3 ?$ C6、两天后半量换液，同时添加IL-4和GM-CSF
( j3 I& c  G0 P/ @' c6 o7、5天后添加TNF-α进行诱导50ng/ml，诱导1~2天( B/ ?8 k1 {9 K4 ?% \+ h
不知道这个方案会不会存在一些问题，因子的浓度合适吗？& v: n7 L. Y2 R3 v. I
诱导后的DC不增值，一般100ml外周血能诱导出DC细胞的量是多少？/ |) R: T  t) u4 V$ S  w9 \1 u+ n
流式检测CD80, CD86,CD83、CD11c、HLA-DR，做完表型分析，基本上就没有多少细胞了，或者根本就不够用来做表型分析.- n6 G, d7 d) U8 q, Z+ h$ m+ \: D6 X
请问下做DC-CIK细胞回输人体，要不要做流式分析？

flowguo

        以前养过，看步骤应该差不多，细胞因子浓度具体记不清了，不过很多文献上都有诱导方案，一般没有什么问题。我觉得单核诱导DC经常会混有很多淋巴细胞，贴壁后最好洗干净一点。- Z- o$ q; L; C& ^1 U
     以前都是200ml的血，诱导一个星期不出问题的话1X10^7没问题，纯度能有80-90%，多多少少还是会有淋巴细胞。不过时好时坏，有时候也很差，都不知道什么原因。
3 E) q. g; w# W8 P9 ]; Q     表型鉴定我觉得你不一定每次都做吧，养多了有感觉的，树突的形态很典型，真要要求高的可以挑选着做，流式多标的话也要不了多少细胞。& g9 m/ Z/ P+ O
      临床试验不是很了解，同问。

flowguo

        以前养过，看步骤应该差不多，细胞因子浓度具体记不清了，不过很多文献上都有诱导方案，一般没有什么问题。我觉得单核诱导DC经常会混有很多淋巴细胞，贴壁后最好洗干净一点。, M4 a9 k5 \1 Z8 M- n
     以前都是200ml的血，诱导一个星期不出问题的话1X10^7没问题，纯度能有80-90%，多多少少还是会有淋巴细胞。不过时好时坏，有时候也很差，都不知道什么原因。
7 M9 _5 J" I5 Q! h5 H     表型鉴定我觉得你不一定每次都做吧，养多了有感觉的，树突的形态很典型，真要要求高的可以挑选着做，流式多标的话也要不了多少细胞。
4 |( a6 m8 N# \# n: c4 t      临床试验不是很了解，同问。

yubin083

想问下这样培养出来的细胞中有macrophage吗？如果有，大概有多少比例？

hwlightning

回复 yubin083 的帖子
0 D/ S6 W& N4 T, b  b+ r" F) h0 w3 o- y% c9 G; j& s+ z
我今天看细胞的时候发现有很多贴壁的细胞，但是贴壁的细胞也有很多树突状。

透明之蓝

3、在37℃，5％CO 2的潮湿培养箱中孵育2〜3小时
; w% B: ^" y* N3 h3 F: ^& p: V 4、弃掉含非贴壁细胞的培养基: i/ f* }6 ?1 [# X& l

6 P. l9 q+ _3 u弃掉培养基要注意，格外小心，轻轻操作！！要不细胞会损失很多！！
2 T8 ~: @& U( |+ j3 v! `  o+ @关于其它问题，同问！！

yubin083

回复 hwlightning 的帖子0 |4 k' G" k# n% M* N8 t8 j! r8 T. U

- ^( U+ T" a3 R样子有树突，不一定是DC，有一部分可能是巨噬细胞，这种细胞有小突起，而且贴壁，比DC还牢靠

yubin083

关于血液中单核细胞的分化为Mφ和DC2 z0 D$ F" W  d, v' k
这种关于这种DC（表面CD1+，CD11b+，CD14+/-）国际上是有争议的，至少已故ralph steinman教授就不认可

yubin083

诚然，从人体血液中培养获取获取DC亦然成为不少researcher的研究方法，我仅仅想了解依靠这种方法获得的DC的纯度到底有多少（排除淋巴细胞后），其表面CD表达的情况？

hwlightning

回复 yubin083 的帖子) ~) z4 b2 a0 n& R* j) B# C$ T

! b5 @) q0 H& h. i) x( e( e是不是成熟的DC细胞是悬浮的细胞，) h7 b/ e0 U; V& B5 r
我最近看我养的DC有很多悬浮的，和贴壁的，如果我半量换液的话会不会损失掉很多细胞？+ b- E- C" D0 D1 X, Y0 Z( K/ }