求助 关于大鼠骨髓间充质干细胞分离培养

chengge21

本人新手，提取了几次大鼠间充质干细胞，所用方法大体如下：1.将SD 大鼠断颈处死，浸于75％的酒精中5 min。$ [0 R7 l/ P; G0 i; f8 }
2.无菌取双下肢并剪去皮毛，剔除股骨、胫骨周围肌肉组织等，再用灭菌的PBS 反复冲洗。
5 W$ v' L  q$ K8 Y( f+ Y, Q8 [3.剪去骨的两端，暴露髓腔，用1ml注射器针头穿刺两侧骨端，用含10％胎牛血清的DMEM培养基冲出骨髓，用1ml注射器针头反复吹打。
2 T2 ~' T2 K  ~% L6 Q4.置于10 ml 离心管中，1 000 r ／ min 离心5 min，弃上清。
7 I% I$ z* |) r2 @7 U) g5.再用含10％胎牛血清的DMEM培养基反复吹打，重悬细胞。
# K+ y  k& ^+ j; g* y: {6.接种于培养皿中，于37℃，5％ CO2，饱和湿度的培养箱中培养，24h后更换培养液，弃去未贴壁细胞，此后每3 d 换液1 次，细胞长至90％汇合后，用0. 25％胰酶消化，传代。           用这种方法提取出来的细胞，24小时后贴壁的很少，而且长势非常慢，细胞形态也不好，提取几次都是这样，请大家指点一下。                                                                                                                                       

wujh1986

全骨髓培养就是这样子的,杂细胞会比较多,你可以把骨髓冲洗下来后,密度梯度离心,分出单个核细胞,再去培养,不要24小时就换液,前两天不要总是拿出来看,三四天后半量换液就可以了啊

live861215

回复 chengge21 的帖子2 A% G& e4 n4 b* ]  b4 I
$ u6 f- r& p$ s
建议你第二步用DMEM培养基冲洗，这样能使细胞处于一种有营养的状态，用PBS冲洗，可能会对细胞有影响，你可以试试。我培养全骨髓时，也遇到了和你一样的情况，细胞不仅贴壁的少，而且长得慢。

张贺吉

离心速度有点低，我用1500rpm，好像好些

xiangsi414

吹打的过程要注意，尽量轻柔，避免机械损伤造成的细胞死亡，本来小鼠骨髓中能提出的间充质干细胞就是很少的！

sysuhoo

就个人经验来看，吹打力度和离心速率对细胞的影响不是很大，楼主细胞的情况应该比较符合二楼所述，另外最好在冰上操作，维持低温，分离骨头用3%的pbs较好，冲洗确实应该用培养液最好

chengge21

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4 z8 B" \3 b7 o5 Y* `7 E3 |4 `, v% }3 x+ m
密度梯度离心是用淋巴细胞分离液吗？如何操作？