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[讨论] 关于干细胞染色体核型分析的一些问题

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发表于 2012-11-1 16:38 |显示全部帖子
近期在干细胞染色体核型分析前,在制备染色体的时候遇到以下情况:" Z' E2 ]+ |+ v6 M4 z% R: ?; o; T
1 .不知道怎么选取细胞,过早则看不到任何染色体形成,太迟形态也不对
( d+ a9 }) W9 R6 K; }( a0 F2 .最大的问题在于低渗处理的时候,没有办法破膜。
* y( Z6 u+ z# ]' m% m求助:1.如果选择用于制备染色体的细胞
  R/ Q# ~8 l5 O8 u" b$ g5 t: e4 B           2细胞低渗处理方法如何优化?
9 N, i* U" Q4 O' x% n' K: a谢谢各位i!
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发表于 2012-11-1 20:39 |显示全部帖子
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发表于 2012-11-2 08:46 |显示全部帖子
1、用秋水仙素( i* R. u" K/ A$ D  F3 l6 }" Z, Z
2、自己配低渗液,KCL好像是
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金话筒 优秀会员 小小研究员 热心会员 帅哥研究员

发表于 2012-11-2 12:14 |显示全部帖子
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选择的细胞,必须在对数生长期,这个就要根据你的细胞本身的特性,以及接种的密度都有关系了。你可以考虑一下取24h,和48h的比较一下,一般细胞都是这之间。实在不行的话,估计就要做个生长曲线来确定一下你的细胞的对数期。. I4 Z4 V- q6 R" s* k0 M$ y$ k; z
我认为你第二个问题也是因为没有选到对数生长期的细胞造成的,一般的话,低渗还是比较容易。你做个梯度,20min,30min,40min试试看,一般也就是30min就行的,所以,还是应该摸索一下你的细胞的对数生长期才是最关键的。
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发表于 2012-11-2 14:30 |显示全部帖子
回复 xbs530515 的帖子+ T2 o) ^& C; h, ~

# i) v9 n( i, a; b嗯,说得有道理,第一次有40%的细胞是可以看到分散的染色体,形态也很典型,固定和染色都不错。但第二次的实验结果失败,选取的细胞是36小时的细胞,低渗和固定后看到的细胞里看不到染色体的存在,低渗的话应该只是胀大,并不需要细胞膜破掉,我用的是KCl0.075M,作用时间为30min,秋水仙素的使用浓度为终浓度0.45ug/mL。
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发表于 2012-11-7 14:54 |显示全部帖子
回复 SKC-SFC 的帖子# ~' j% P; e! p& n: J2 S$ {9 @* f
! x' A# a. G, T; e- ~4 b) R: P
     能看到分散的染色体,关键是滴片,注意利用热胀冷缩,具体方法不透露了。只要掌握好距离滴片,一般很容易的。
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发表于 2012-11-9 17:20 |显示全部帖子
回复 突击兵之小土豆 的帖子
, F! K. }  x" L6 b. B1 p- V9 ?3 i9 B( {3 |5 c9 W4 Z: C7 U
嗯,说得很对,不过距离太高貌似滴不准
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发表于 2012-11-12 15:00 |显示全部帖子
回复 SKC-SFC 的帖子
4 l0 g8 ?7 r7 m2 p6 H3 A5 H' z) Q! y% |7 {+ l6 D
7cm左右吧,一手拿吸管瞄准,一手拿冷的载玻片(注意要有雾气,没有立马不要),瞄准,然后快速滴,不管滴的怎样,快速滴20个板,最后画圈,用松脂封片(我个人比较喜欢松脂,本来还想手工做个琥珀呢)。熟能生巧,多练就越来越准的。加油啊* J6 \$ E5 ]: t" r# o
% r/ ]3 n, Q0 b: C- ^% B
这个方法是老师傅的方法,不外传的,我说了。一定要给我很多威望和包包啊,要不对不起我啊!!
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发表于 2012-11-12 15:00 |显示全部帖子
回复 突击兵之小土豆 的帖子: F, g$ F' u) ]( j; d6 L& c* z

6 E0 K. l. f& J, `70CM   打错了   

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发表于 2012-11-13 09:06 |显示全部帖子
回复 突击兵之小土豆 的帖子8 [, N. \' ~3 l8 G4 M3 S  q8 X8 x" l
: G7 ?$ D5 ~0 m$ d
70CM 要滴准,那技术得多精湛呢,而且滴片还是应该先滴一片,看看大致的细胞密度吧
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