成骨诱导液配置问题，怎么灭菌？

ygxdnh

最近做诱导MSC成骨，配了成骨诱导液，但是加了诱导液的全部染菌。. ~" J  k: m, d
配置方法是：2 ]  y0 v# t' {; b8 C
1、按比例称VC和B-甘油酸钠（下面用B代替）
$ o7 T3 P3 ?! K2 J( q; [7 K2、DEX溶于酒精1 J' j" T( \. ]
3、在α-MEM中加入VC，B,及DEX，这时培养基变黄（不知道大家配出来是否是黄色），再用0.2mm的过滤器过滤。
7 j0 D# z* c, s* D& O7 r' i最后加入孔板。但是都染菌了。大家配置诱导液是怎么灭菌的，按道理说用了0.2mm的过滤器应该不会染菌吧？

sdyinong

VC因为是酸性的加入培养基中培养基是会变黄的，建议配置VC和B时先用高压灭菌的去离子水溶解，溶解后用0.2um膜过滤，过滤后再加入到培养基中，诱导培养基现用现配，效果会好一些

stang198651

按理论过了0.2um就无菌了，但在实际操作中会存在很多意外，一般情况下，过滤完最好能做个无菌试验，以确认无菌。目前了解到的情况有限，就存在很多种可能：加液前污染，加液中污染，加液后污染。加液前污染包括滤器的滤膜穿孔、滤器被污染、容器被污染、无菌操作失误、超净台故障无法有效过滤、加液前细胞已经污染。做无菌试验就主要是排除过滤失败而造成的加液前污染。

回到从前

你好 还做别的鉴定吗？

jenvy121

0.22滤器过滤不会污染了，肯定是操作过程中出现了问题，亦或是你的过滤就是不正确的操作导致溶液污染，先进行菌检在进行染色比较靠谱。

ygxdnh

回复 sdyinong 的帖子
+ k& s+ E6 C: o. s
) p* ?& a. @3 q如果我把VC，B，DEX都溶于PBS（少量），然后再过滤，最后加入到无菌的培养基里面，可否？

ygxdnh

stang198651 发表于 2012-11-8 12:34
. y4 k  d* o& Y5 q9 M" M  b4 p按理论过了0.2um就无菌了，但在实际操作中会存在很多意外，一般情况下，过滤完最好能做个无菌试验，以确认无 ...

' B3 I: f" h9 t, i我也觉得可能是操作原因。

ygxdnh

回到从前 发表于 2012-11-8 12:43 ; c: r9 v1 C0 Y. X
你好 还做别的鉴定吗？

/ c% E! [& N2 Z2 ?) M8 w
没有，我们这边主要做材料，细胞只是做个评价，没有做那么多鉴定。

ygxdnh

jenvy121 发表于 2012-11-8 14:23 6 k; v6 Q% H8 j& {' c2 S; r/ k
0.22滤器过滤不会污染了，肯定是操作过程中出现了问题，亦或是你的过滤就是不正确的操作导致溶液污染，先进 ...

/ ?& k' J& s% u谢谢

stang198651

我们原来是用重复使用的滤器。用完之后清洗晾干，用时清洗，用超纯水泡滤膜，做好之后用注射器推注空气试验漏气或穿孔没有，合格的再用铝箔纸仔细包装再灭菌，灭完之后自然冷却不排气，然后直接拿出来，不烘干，用时小心打开滤器上端铝箔纸，再用注射器试验漏气或穿孔没有，合格的进行过滤操作，过滤完之后再用注射器试验漏气或穿孔没有，然后再做无菌试验，过滤N次，一次没有污染过。