[求助]小鼠胚胎干细胞体外定向诱导技术求助

干细胞狂想

貌似你要贴壁养的花，应该铺在MEFF细胞上吧，需要一层滋养层细胞打底，这才能贴得好~~~胚胎干养起来是麻烦些啊~% h& A' g2 l% y* b$ o5 W$ e% L( [5 b$ r

summer0914

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  Z, d1 t$ t/ a) e) D  r5 @% h7 d; V2 Y. o  |6 g3 Z: C
我们实验室用的是CGR8系啊，可以不用饲养层的~

yedanna

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前面两天，不要动培养皿，也不要换液。2-3个EB/孔，也不多，合适了。# ^' f* _- e  Y% n/ R! N9 A
你能具体说一下你的培养方法吗，看看原因到底出在哪里

summer0914

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3 }* v" P7 {/ C* T! E! d  v! m. \( \) l8 T/ Z
培养基：GMEM粉剂加NaHCO3调PH至7.3左右，20%FBS，1xNEAA，1xSodium Pyruvate，1x双抗，10(-4)M的2-ME，完全培养基加10(3)U/ml的LIF。
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细胞融合至70%左右时传代。但有的时候当天细胞密度不是很大，隔夜就会长到大于80%，再传代。
3 ?: f. N. A9 E3 K
& c4 ^1 Z! q+ @2 z: b8 z0.25%的胰酶消化1-2分钟，观察到有细胞开始细微脱落时加培养基终止消化，然后吹打十几下的样子就可以分散成单个细胞，但有时能观察到培养皿中有融合成一片的那种死细胞。不离心，1000-2000个/20u静置悬滴2天，悬浮2天期间摇动防止贴壁过多，然后就转入24孔板了，VC刺激分化。现在做的是每天换液，至转入24孔板后的5-6天开始观察。6 W7 i& N5 |9 v4 s% `6 I
1 R- W, f* \( J+ p$ O! C
请问yedanna是不是哪里出了问题哦？

yedanna

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  h$ m, H+ S0 a7 [
+ W% m3 p# `% z# O你们用的是无滋养层培养胚胎干细胞吧。悬浮两天用什么培养皿，是用细菌级的培养皿吗？悬浮培养才2天就转入24孔贴壁培养了？是不是时间太短了，所以贴壁效果不好，然后影响分化呢？

summer0914

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. P( s! r2 m4 e, F
/ F3 T7 r. c, s7 T+ o是，CGR8系不用饲养层的。悬浮培养我看文献好像就是2-3d？用的是国产的细菌培养皿，你们实验室用的是进口的超低吸附的培养皿吗？悬浮几天呢？谢啦~

summer0914

回复 yedanna 的帖子3 @0 Q+ J8 @9 }" c& f4 f

% S" }' j4 v# A我还有两个疑问就是我要用VC刺激，是从悬滴开始就用加药的分化培养基培养，还是贴壁培养的时候才用？另外一个就是，文献说8-12天可观察到搏动，是指从哪步开始的第八天？

yedanna

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' A; [  h1 c7 _2 w- S5 s+ l3 t
& [; E+ |! [+ B; r' ^$ J% O9 [7 _我们用的都是进口的细菌级培养皿。我一般悬浮7天

yedanna

回复 summer0914 的帖子! c) R! I2 G7 ]+ x+ c8 E; [
' F7 A8 O' W1 k, t
一般是贴壁培养再使用VC刺激，8-12天一般指的是贴壁培养后的天数，不算悬浮培养的天数

summer0914

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5 K  {/ b: f% X1 P* f' K回复 yedanna 的帖子; D$ |, m! f" O2 _. H

- y% g; u6 k# `2 i5 V) N能悬那么多天啊，看来还得用进口的，国产的三天就贴壁贴的差不多了~请问你们用的什么牌子的？货号？还需要什么特殊处理吗？