[求助]小鼠胚胎干细胞体外定向诱导技术求助

干细胞狂想

貌似你要贴壁养的花，应该铺在MEFF细胞上吧，需要一层滋养层细胞打底，这才能贴得好~~~胚胎干养起来是麻烦些啊~
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summer0914

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我们实验室用的是CGR8系啊，可以不用饲养层的~

yedanna

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: X" u  v. _6 f
) `/ n! b" u* Y0 @5 B前面两天，不要动培养皿，也不要换液。2-3个EB/孔，也不多，合适了。9 F: ^2 M! F+ ]1 o, d6 B
你能具体说一下你的培养方法吗，看看原因到底出在哪里

summer0914

回复 yedanna 的帖子/ `" s8 \+ P- J0 j5 F/ x9 M' h$ V$ _

$ @# G+ H/ a4 J( z: q" f. h培养基：GMEM粉剂加NaHCO3调PH至7.3左右，20%FBS，1xNEAA，1xSodium Pyruvate，1x双抗，10(-4)M的2-ME，完全培养基加10(3)U/ml的LIF。9 D! D3 ~' n9 e, x" ]

! {' R; m2 K" m; O9 }( a2 _6 C细胞融合至70%左右时传代。但有的时候当天细胞密度不是很大，隔夜就会长到大于80%，再传代。( J6 b# P4 J6 Z1 X- U
) H1 x9 i5 W  p* k+ U" u4 t
0.25%的胰酶消化1-2分钟，观察到有细胞开始细微脱落时加培养基终止消化，然后吹打十几下的样子就可以分散成单个细胞，但有时能观察到培养皿中有融合成一片的那种死细胞。不离心，1000-2000个/20u静置悬滴2天，悬浮2天期间摇动防止贴壁过多，然后就转入24孔板了，VC刺激分化。现在做的是每天换液，至转入24孔板后的5-6天开始观察。6 |3 N; ?4 G- ]  U' c! f

$ W6 x9 G) r% ]. U) Q' r" F3 I请问yedanna是不是哪里出了问题哦？

yedanna

回复 summer0914 的帖子8 L% j* j; h  ?! ]7 N6 X
7 Z3 H+ i6 G1 `3 d* s, m+ P  M- w
你们用的是无滋养层培养胚胎干细胞吧。悬浮两天用什么培养皿，是用细菌级的培养皿吗？悬浮培养才2天就转入24孔贴壁培养了？是不是时间太短了，所以贴壁效果不好，然后影响分化呢？

summer0914

回复 yedanna 的帖子/ o! f  R+ X0 V# d" r  t: E

* K* Q% g- U( Q* E1 ]是，CGR8系不用饲养层的。悬浮培养我看文献好像就是2-3d？用的是国产的细菌培养皿，你们实验室用的是进口的超低吸附的培养皿吗？悬浮几天呢？谢啦~

summer0914

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0 H$ h9 G) o2 q' x1 V% u8 ~$ h) r
' A. D9 B% I/ i+ [1 H/ }) e我还有两个疑问就是我要用VC刺激，是从悬滴开始就用加药的分化培养基培养，还是贴壁培养的时候才用？另外一个就是，文献说8-12天可观察到搏动，是指从哪步开始的第八天？

yedanna

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9 D( f4 \, Q8 o- o
) m/ B6 g/ B( ?2 a我们用的都是进口的细菌级培养皿。我一般悬浮7天

yedanna

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+ b, i. U. G' T7 |" L2 A" r8 A5 ]# z  b2 ?2 U0 }9 j- ~/ \
一般是贴壁培养再使用VC刺激，8-12天一般指的是贴壁培养后的天数，不算悬浮培养的天数

summer0914

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" P8 B+ s* t6 u2 h* D回复 yedanna 的帖子0 ^9 n+ e8 ]/ O. L& S
, w! Z! R! U3 @7 B' R' a
能悬那么多天啊，看来还得用进口的，国产的三天就贴壁贴的差不多了~请问你们用的什么牌子的？货号？还需要什么特殊处理吗？