求助：我的CIK怎么了？

突击兵之小土豆

     最近养CIK连续一周了，分血后细胞计数存有大量黑色小点，反光，个人怀疑是血小板。培养几天后，有的瓶子，黑点越来越多，贴壁居多。四五天后，贴壁主要是黑点，养的CIK细胞死的很多，扩增很少。请问谁知道怎么回事啊？+ H, ^" H  K4 e2 z" X' {' h
  分血了8份血了，都有这个情况。是个人操作吗？  那为啥以前没有呢？还有最近发现离心机离心后，就是吸白膜层的时候，发现白膜层下的FICOLL是红色的，以前一直是白色的。是FICOLL的原因吗，最近用的是新批号的。( x( Q# ~8 M" H) W
  
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, v6 b( C, Y8 K6 b( H( x   具体描述黑点：细胞计数时，不是用台酚蓝染色吗，绝大数CIK细胞体积较大，但是其间存有少量体积小的也是很亮的细胞。当混悬细胞培养时，在奥林巴斯倒置显微镜下观察，10乘20倍像素下观察，显黑色，但是调节粗螺旋和西螺旋观看，可发现黑点也反光。   做了各项物质的内毒和革兰氏检测，无菌也做了，都没问题？0 o( J2 c$ y8 z3 a
   原因何在啊？
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! b- x- a" d1 O0 I1 O$ A0 O  元芳，此事你怎么看？  

突击兵之小土豆

顺便提一句，11月14日 ，本人清理了一下孵化箱，用纯化水加苯扎溴铵，清洗了一下孵化箱，于是从11月15日，噩梦开始。6 \& n* a, H! p- ^* @

1 D5 d, V9 Y: z( f; w, w后来于11月22日，又重新清理了一下孵化箱，27号分血，今天28号观察还是有，可是有意思的是，一瓶多点，开始贴壁，一瓶很少。顺便说一下，先头分血的，有的丢了，有的加因子处理，扩瓶了，后来细胞长起来的，黑点越来越少；而黑点多的，现在细胞很少，瓶底成了黑色的海洋。

mkhorse

发图片上来看看

bloodroses

白膜层下面的ficoll成红色，如果每份血都成红色，应该是分离液的问题，如果个别血样成红色，应该是样本差异的问题。

kiss2346

白膜层下的FICOLL呈红色，估计分离液有问题的可能性比较大，可以适当提高离心速度，或者铺平面的时候多分出来几管试试。
0 b6 B' F; M: c2 S! `我想知道你的CIK做法，在单个核分离前是否进行血浆分离？分离结束后是否进行贴壁分离DC与CIK？是把单个核细胞分离后直接按照CIK的方法养的？$ Z  Q9 ]" S' Z: @6 W8 `4 V
我感觉你说的嘿嘿的东西是血小板，可以试试先进行血浆分离再做。1 W- s# e( W7 g3 @, C! X
我不是很确定 所以仅供参考

突击兵之小土豆

回复 kiss2346 的帖子! ?1 c: d& e" O" m; u
4 b5 z4 |+ @2 x& R4 k
最近一直挺忙的，首先，我的CIK是分离血浆的；第二，分离后进行贴壁分离DC\CIK；第三，我们提高离心速度后，分离液又变的透明了，查看了厂家FICOLL的说明书后，大致可以推测可能是气候原因，天气冷了，GMP车间内温度最近一直在20度以下。1 c: \. l9 t. n" |% O4 h# `

  w  ]  A; `! @2 V 再提高离心速度后，分血依然存在黑黑的东西，手机拍不了照，郁闷。不过现在离心后，少了很多。有人说是血小板，有人说是细胞碎片，有人说是粒细胞。3 \7 E! H1 k! ~+ s# z- g: V  k3 P

5 T/ v% l# N% ~, e9 u( I   镜下观察，在4×10下观察，与透亮的细胞相比，小很多，呈黑色颗粒，观察有悬浮的，不过绝大多数贴壁。  在40×10观察下，调节粗细螺旋，可以发现，这种物质呈绿豆样，在一定角度下，也反光，透亮。
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+ j0 a5 l3 a4 G) U元芳，你怎么看?

kiss2346

回复 突击兵之小土豆 的帖子) y5 k4 w+ J4 q

" ?: z6 n/ ]" z1 L1 g你每次做培养之前不会用计数仪进行计数么？ 最近每次做的时候在正常要进行贴壁培养的时候，再添加一步1200/10min的离心，能够较好的去掉血小板，如果不放心可以再加一步。看看效果，感觉一下是什么东西在里面。还有一种可能那些东西是红细胞，不过红细胞在培养一段时间之后一般会自行裂解，不过有红细胞 和血小板的细胞在初期看的时候培养液都会非常脏，一直有各种各样的碎片在里面。这个还是要你自己去判断了，天气变冷适当调节一点条件试试吧

kiss2346

还有最好是在培养前进行一下计数  用仪器。。。。这样可以初步判断 血小板的量 红细胞的量  还有你分离结束后 分离出来的细胞沉淀是不是红的？还是白的？如果是红的 真的很有可能是红细胞在里面 。

ljl1988115

你在培养过程中是否加了血清，有没有可能是黑胶虫