最近在做Western Blot（WB）,遇到一些问题，想请教下大家

Andyhigh

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) p0 m$ e" J8 B1 Y/ z
. o# i% d/ ~  x- q/ e楼主好建议，想问下你做出来了嘛？你做的也是蛋白诱导？
$ P( \* E6 B! I

cyberpig

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Andyhigh 发表于 2013-5-24 21:43 4 v' U0 m6 l3 b* b
回复 cyberpig 的帖子4 ?, Y- Z  P3 P
0 C9 u3 \3 \$ m3 h/ t7 }) }
楼主好建议，想问下你做出来了嘛？你做的也是蛋白诱导？

# x& {1 ?; L* k8 }3 L8 f; f
, R5 h+ ?3 F7 H) Y+ m5 j
我也是做IPTG induction。有些做出來了，有些做不了，要再試一下其他strain的competent cells。

Andyhigh

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% `/ A' }# K- d6 S; N( j; M( Y$ v8 d$ U. J/ N
那想问下，你的感受态细胞用的是什么？是BL21（DE3），BL21(DE3)pLysS，还是其他的？？？

cyberpig

Andyhigh 发表于 2013-5-24 23:45 . m) L  i3 O& h  ?8 P
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- q- C% z7 h1 K
2 A  P% S+ T" U3 t7 O- d那想问下，你的感受态细胞用的是什么？是BL21（DE3），BL21(DE3)pLysS，还是其他的？ ...

% d9 ~9 T/ b+ [/ I2 X- @8 FBL21, pLysS也有用~

DNAngle_RNA

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: R; H0 Z) W) v! A- |* c5 R4 m. s; ?5 K+ X
建议楼主- g6 ?- k' Z! X8 _# x  U1 {7 |! \5 J
1、裂解液不要加太多，如果蛋白浓度很低，几乎是看不见条带的，于冰上（或4度）裂解，碧云天的裂解液我也用过，本身就是有点粘稠的。% i1 ^' g2 |( B  g& I8 a
2、蛋白变性理论上100度10min，但我也试过只煮沸5min的，似乎也没啥问题，这里建议楼主检查一下loading buffer是不是有问题，我之前有一次杂不出条带就是因为loading buffer导致蛋白变性出了问题。3 S! p- z$ U2 Y7 [# [) N: e
3、全蛋白做考染，个人感觉意义不大。/ M0 Z/ ~* M' c
4、关于转膜，marker能转过去，理论上蛋白也是可以转过去的。8 T5 a8 `6 F& f2 o/ q/ q' O. f- _
5、一抗的质量是做WB最重要的，楼主最好先确定抗体有没有问题，如果不是，那就是蛋白提取或变性出了问题。

Andyhigh

首先谢谢大家，其实前天就把内参跑出来了，由于时间原因，就没回帖。
1 w0 P) h* c2 ?% ^2 _2 c
7 ?; d% l: p- z( B* F可能失败原因：) l, v7 G/ W, ?! ]7 q- }
1.TBST没有调PH，就直接用来稀释二抗，可能是导致本次试验的原因。
8 g$ G: H5 K$ P! I' {: P; T; U2.一些操作上的细节：如  是否在冰上裂解获取蛋白   转膜的条件及时间  滤纸 胶 膜的顺序  $ Y6 a/ q- }( ^2 t

7 R9 C$ w- P5 p- t* h心得:3 |1 p- q* o- U2 Z
1.如楼上所说，做全蛋白的考染没有什么意义；如果按楼上某个人收的，做个诱导前后的对比，还是有点可行性的。
7 u& x7 q6 d5 y9 x) C! ~% d2.事先检测一抗和二抗  发光试剂是否存在问题/ b, {7 |6 _7 ^6 y
3.做阳性对照
8 p$ v4 _& [' K& L
& S* D9 g/ V+ X9 t4 o" {在这里还想问下，用细菌（如 大肠杆菌 BL21（DE3））,其中有哪些蛋白可以做为WB的内参？  新手，请原谅啊···* q) M" O$ Q1 u$ b# {4 |3 r
    ! O% j, }$ _. h" b. k* j
  

Andyhigh

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- A0 z" j, Y  k0 \3 Y% G
$ t3 g3 g* Z( p8 J0 ?2 P+ r3 j我用iPSCs做阳性对照，跑了个Tublin内参，结果WB呈现阳性结果。4 Y# i; D2 g+ T7 Z/ J' V- ?
想问下，用细菌（如 大肠杆菌 BL21（DE3））,其中有哪些蛋白可以做为WB的内参？ 我手头有B-actin  和  Tublin  

Andyhigh

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* R5 i* q1 x: \: M4 g- V/ f. ^
" Q# ^# C0 w4 S# X) G) _) |! E我用iPSCs做阳性对照，跑了个Tublin内参，结果WB呈现阳性结果。6 p) X: }8 [7 t" c
想问下，用细菌（如 大肠杆菌 BL21（DE3））,其中有哪些蛋白可以做为WB的内参？ 我手头有B-actin  和  Tublin   ' A% H4 s) @6 Z  b1 K- E
6 Y  b) C# I' \( T8 r% W2 X
还有其他内参嘛，或者有相关文献嘛，能给我发下不？

cyberpig

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& e) P2 u  ]- [9 x我做western時沒有做內參，因為我想表達的是帶gst tag的protein, 所以只用了已知gst +ve的樣品來做外參。而做sds page時，我則用了未誘導前的lysate做內參。

Andyhigh

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& Y7 s9 S$ ?- Y3 \; c( J6 L/ W
9 i. `3 b* X& m1 Z% N; L3 w: c1 \我的试验目的和你差不多，我想表达的是带His tag 的protein，不过我想问下你回答中的"gst+ve的样品 " 是什么东东啊 ，ve代表你的蛋白质？
) ?5 v2 n4 S) d( P0 {  [
1 p5 t/ c- B$ g: \6 H8 T$ X9 Q还想请教一个关于competent cells的问题，BL21 和 BL21 pLYsS 在后期细胞裂解上的主要区别是体现在是否表达溶菌酶上嘛？你是根据什么来选择这两种感受态的，最近在犹豫是否改用
  D7 Z9 X+ @+ H. |BL21 pLYsS 已方便后面的超声波裂解，自己手头有了 BL21 和 溶菌酶。期待您的回复