最近在做Western Blot（WB）,遇到一些问题，想请教下大家

DNAngle_RNA

回复 Andyhigh 的帖子7 j3 |% v- L  i
9 n8 W- R( }0 ?/ I) R
好像做原核表达鉴定蛋白不用做内参吧，至少我没听说过，一般来讲做SDS-PAGE鉴定就可以了，严谨的话再做WB

Andyhigh

回复 DNAngle_RNA 的帖子1 I; h, Z4 b& W+ ~3 g* _

8 T* ]9 m' T. @! M$ B哦 ，我就是想用原核系统表达并提取 纯化我的目的蛋白

DNAngle_RNA

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" r; q7 L, }7 u, c- ]. R
! ^* k" D' F5 Q' f1 |" v* Q1 i2 Y恩，表达纯化，再做WB鉴定就可以了

cyberpig

GST +ve (positive) 指已知帶GST tag的protein (作western blot外參)。我想表達的東西同時有His和GST tag的。
/ q) F# K( F% P/ U& _0 d) F# f* G1 U  Y
BL21和pLysS的分別應該只是有否表達溶菌酶，而我選這兩種是因為我們實驗室最常用這兩種。做IPTG誘導的話，它們的分別不大。但做autoinduction的話，pLysS不能用就是了。如果這兩種都不行，只能試一下rosetta, C41等。
4 F! W2 m) S6 N5 E5 y
8 o' b5 u  ?2 }

hbs08230

在转入BL21以后需要做一次small scale的测试看看表达量。
; s. b4 L. R. l) w$ h7 g  i在涂了BL21的细菌板上挑5-10颗形状规则的克隆，用培养液摇床上过夜培养。第二天，每一颗克隆取10ul+10ml培养液，加上两个control，然后上摇床培养，直到OD值达到0.8，然后一个control不加IPTG做negative control，另一个和所有克隆一起加0.2M IPTG 做positive control。摇床4-6hrs让其充分。 所有培养液上离心机去除上清，留pellet。所有pellet各加1ml lysis buffer后vortex均匀，超声破碎3min，5s on and 5s off。一万转离心10min，收上清，收pellet。此时的pellet再加入1ml lysis buffer后vortex均匀。准备run gel。
4 h( a/ v# Y- Q7 x! h上清的上样量：20ul，pellet的上样量：5ul$ d* u. K+ f. D
加好loading buffer，95度10min。
! |6 e3 P* @. x) t$ D' S只要你的marker跑好就基本无碍。
3 U3 |9 V$ J; Z3 U* s/ d考马斯亮蓝染色至少20min，脱色20min一次，共换3次后加多些脱色液通宵摇床上浸泡脱到无背景色。6 l6 o' o( i/ W
有negative control做指标，在你想要的KDa位置上蛋白斑越大表达量越高。如果没有negative control做指标就不好说这个位置的蛋白斑是不是被IPTG; h& Z1 N9 S4 \4 l8 {( o  v& M
induce出来的了。9 r9 I/ `4 u9 P" N
如果上清中没有蛋白斑，但是pellet里有就说明超声破碎不够。

Andyhigh

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4 b0 j; {' y0 A  ~& v  [- z' T, f6 r: F  M1 t! h8 R( A) w
好的  首先谢谢hbs0230  今天在图书馆写了一天东西，实在是不想仔细看了，明天仔细推敲推敲···  谢谢了

Andyhigh

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# o8 \1 R6 J( U9 ~: Z3 `
7 t. M. a' c6 t" Y好的  首先谢谢hbs0230  今天在图书馆写了一天东西，实在是不想仔细看了，明天仔细推敲推敲···  谢谢了

fengjh100

" S; Y! u- {' X( N
$ H& C$ z% A. T9 t/ L0 v: X根据楼主情况，我觉得提取蛋白是关键，提取蛋白有些环节是不能忽视的，能保证在以下四点没有问题，基本上是可以使用的：1是在冰上进行；2是裂解充分；3是变性良好；4是定量准确。跑WB也有很多环节，各个环节都可能导致没有良好的条带出来，建议行点杂交实验摸索下。至于用丽春红 染色 ，个人感觉还是不怎么靠谱。所以建议：重提蛋白（最大可能是蛋白提取的不好）。至于电泳和电转，分子量不大的话可以低点的电压，电泳时用250毫安就应该够了。很多细节可以认为避免的应该注意。祝早日跑WB成功！

Andyhigh

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